馮金 洪愉 黃芬 井申榮 曾韋銀

摘要：為研究Profinity eXact系統(tǒng)在蛋白表達(dá)及純化過程中的效果，利用PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因egfp，定向克隆至表達(dá)栽體pPAL7上，轉(zhuǎn)化BL21（DE3），熒光顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的重組菌；取超聲破碎的上清掛柱純化，紫外下檢測純化后egfp發(fā)出熒光的特性，Western blot分析其免疫反應(yīng)性。結(jié)果表明：誘導(dǎo)后的重組菌pPAL7-egfp/BL21（DE3）在紫外光下能夠發(fā)出綠色熒光；一步純化后的egfp蛋白同樣也能在紫外激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，同時(shí)egfp蛋白能和特異性抗體結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Profinity eXacl系統(tǒng)對于可溶性蛋白的表達(dá)和純化，方法操作簡單、快捷，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：純化；Profinity eXact系統(tǒng)；egfp蛋白；原核表達(dá)

中圖分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）04—0310-05

蛋白純化作為后基因組學(xué)時(shí)代研究蛋白質(zhì)功能、結(jié)構(gòu)最常用的手段，已被國內(nèi)外研究人員所廣泛運(yùn)用。隨著純化技術(shù)的發(fā)展，逐漸形成了今天運(yùn)用最為成熟和普遍的親和純化系統(tǒng)，如常用的以GST、Flag、His標(biāo)簽為基礎(chǔ)的親和純化，即將目的蛋白與純化標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，通過與標(biāo)簽結(jié)合的層析介質(zhì)來純化目的蛋白。然而，標(biāo)簽蛋白作為融合蛋白的一部分，其大小、帶電荷性可能對目的蛋白的表達(dá)、成熟、分泌造成影響，其免疫原性可能對目的蛋白的功能研究帶來屏障。因此，對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能等研究，我們期望純化出不含標(biāo)簽的目的蛋白，以避免親和標(biāo)簽可能存在的干擾。然而，如果在親和純化后，再對標(biāo)簽進(jìn)行剪切則使得下游操作更為復(fù)雜。

美國Bio-Rad公司開發(fā)的Profinity eXact純化系統(tǒng)是一套新型的親和層析表達(dá)純化工具，包含了表達(dá)載體和純化介質(zhì)，借助融合表達(dá)的親和標(biāo)簽與同化在填料上突變的絲氨酸蛋白酶結(jié)合，并在鹵素離子（F-或Cl-）或者疊氮離子（N3-）的作用下能精確地誘發(fā)親和標(biāo)簽和目的蛋白之間的剪切，從而導(dǎo)致Profinity eXact標(biāo)簽被固定的蛋白酶滯留在純化介質(zhì)上，僅預(yù)期的目的蛋白從層析柱上洗脫，雖然該洗脫蛋白的N端存在多克隆位點(diǎn)處的一兩個(gè)氨基酸，但基本不影響洗脫蛋白的下游應(yīng)用。為了驗(yàn)證該系統(tǒng)，本文將egfp基因作為工具，通過該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了蛋白egfp的高效表達(dá)，并獲得了不帶標(biāo)簽的功能性高純度egfp蛋白。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

原核克隆宿主E.coli DH5α；原核表達(dá)宿主E.coli BL21 （DE3）；質(zhì)粒pEGFP-N2購自美國Clon-tech公司；表達(dá)質(zhì)粒載體pPAL7購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2試劑與純化柱

DNA聚合酶、dNTP、DNA Maker DL 5000購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶Spe I，Xho I及T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；一抗：鼠抗GFP單抗（天德悅北京生物科技有限公司），HRP標(biāo)記的二抗：羊抗鼠IgG抗體（美國KPL公司）；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自北京莊盟生物技術(shù)有限公司；氯仿、乙醇、氟化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純；1mL空填裝柱購自碧云天生物科技有限公司；Profinity eXact protein purification填料購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3培養(yǎng)基及緩沖液

LB培養(yǎng)基：5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化鈉、蒸餾水1000mL （固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂），121℃滅菌30min。

氨芐抗生素的濃度為：100mg/L。

平衡緩沖液：0.1mol/L磷酸鈉，pH7.2；洗脫緩沖液：0.1mol/L磷酸鈉，0.1mol/L氟化鈉混合液，pH7.2；再生緩沖液：0.1mol/L磷酸。

1.2方法

1.2.1目的片段擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以pEGFP-N2為模板，設(shè)計(jì)引物（表1），并在上游引物5'端處添加酶切位點(diǎn)Spe I及保護(hù)性堿基，下游引物5'端處添加終止密碼子TAA、酶切位點(diǎn)Xho I及保護(hù)性堿基，PCR擴(kuò)增綠色熒光基因egfp。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性溫度及時(shí)間為93℃ 10min；解鏈溫度及時(shí)間為93℃ 30s；退火溫度及時(shí)間為55℃ 30s；延伸溫度及時(shí)間為72℃40s；循環(huán)數(shù)為35；最后72℃ 10min。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化回收，再通過Spe I和Xho I雙酶切、膠回收得到具有黏性末端的目的片段。提取質(zhì)粒pPAL7，同樣用Spe I和Xho I進(jìn)行雙酶切、膠回收得到具有黏性末端的載體骨架，與前面所獲得的具有相同黏性末端的目的片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α中，通過雙酶切及測序進(jìn)行鑒定。提取陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）中以進(jìn)行下一步誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.2目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

選取鑒定后的陽性重組菌pPAIJ7-egfp/BL21（DE3），接種于5mL含青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，復(fù)蘇菌種，按l%比例轉(zhuǎn)接至10mL含青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600約0.4左右加入終濃度為1mmol/L的IPTG開始誘導(dǎo)，16℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約為l左右，取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后細(xì)菌超聲破碎（300W，工作時(shí)間5s，間隔時(shí)間10s，工作30次，4℃，12000r/min離心10min）后上清和沉淀，加入等體積的2xSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后煮沸10min，取10μL上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察。同時(shí)，取誘導(dǎo)后菌液于熒光顯微鏡下觀察，所用激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為507nm。

1.2.3目的蛋白的純化及Western-blot分析

誘導(dǎo)后10mL菌液離心，棄上清、平衡緩沖液重懸沉淀，超聲破碎，離心取上清。10倍柱體積的平衡緩沖液對層析柱進(jìn)行平衡處理后，以每滴間隔15s的流速將上清進(jìn)行掛柱，收集流穿液；用3倍柱體積的平衡緩沖液漂洗柱子，收集漂洗液；用1倍柱體積的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；用2倍柱體積的平衡液置換殘留的洗脫液，最后用1倍柱體積的再生液再生柱子，收集再生液。取純化各階段所收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。同樣，取洗脫過程所獲的樣品SDS-PAGE電泳后，根據(jù)蛋白Marker的大小，截取PAGE膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，PVDF膜經(jīng)10%脫脂奶粉4℃封閉過夜后用1：2000比例稀釋的一抗37℃搖床孵育lh，用含0.1%吐溫20的PBS緩沖液漂洗3次.每次15min，然后用1：15000比例稀釋的二抗37℃搖床孵育1h，用上述的緩沖液漂洗6次，每次10min，最后，加入底物，暗室X-光片顯影觀察分析。

2結(jié)果

2.1目的片段及載體的雙酶切回收

以質(zhì)粒pEGFP-N2為模板擴(kuò)增獲得egfp基因，用限制性核酸內(nèi)切酶Spe I和Xho I雙切，膠回收獲得約720bp目的片段；質(zhì)粒pPAL7經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Spe I和Xho I雙切，膠回收得到約5900bp載體骨架，如圖2所示。

2.2pPAL7-egfp的構(gòu)建及鑒定

將上述雙切回收的egfp與pPAL7連接轉(zhuǎn)化DH5α，獲得重組質(zhì)粒pPAL7-egfp，經(jīng)Spe I和Xho I雙切鑒定如圖3A。重組質(zhì)粒測序證明序列正確。鑒定正確重組子轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），重組子的PCR鑒定結(jié)果如圖3B，表明重組表達(dá)菌構(gòu)建成功。

2.3目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及熒光觀察

SDS-PAGE圖如圖4所示：重組菌pPAL7-egfp/BL21（DE3）誘導(dǎo)后較誘導(dǎo)前，36kD左右出現(xiàn)明顯增粗的蛋白條帶。誘導(dǎo)菌超聲破碎后的12000r/min離心上清與沉淀中，同樣可見相同大小的蛋白條帶，由此可知目的蛋白有包涵體和可溶性兩種表達(dá)形式。

取少量誘導(dǎo)后pPAL7-egfp/BL21（DE3）滴于載玻片上，覆加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察，能觀察到明顯的熒光現(xiàn)象，說明egfp蛋白得以正確表達(dá)，結(jié)果如圖5所示。

2.4目的蛋白的純化

重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎，離心分離上清進(jìn)行掛柱，收集純化各階段的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察（圖6）。在上清樣中出現(xiàn)融合有標(biāo)簽的目的蛋白，在洗脫液中出現(xiàn)剪切掉標(biāo)簽的目的蛋白，大小與理論值相符，再生液中出現(xiàn)標(biāo)簽蛋白，大小與理論值相符。

2.5純化后蛋白的熒光觀察及Western blot分析

取純化后所獲得的洗脫樣在紫外光下直接進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)組中能觀察到熒光，對照組（pPAL7/BL21誘導(dǎo)后的超聲上清）中無熒光，如圖7所示。同樣取洗脫樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白Marker選擇性地截取25～35kD（egfp大小約為27kD）蛋白膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，濕轉(zhuǎn)后的PVDF膜經(jīng)脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育后，加底物于暗室X-膠片顯影觀察，結(jié)果在對照組泳道未檢測到熒光條帶，實(shí)驗(yàn)組泳道檢測到了熒光條帶即egfp蛋白的存在，結(jié)果如圖8所示。

3討論

利用親和標(biāo)簽純化蛋白作為最常用的蛋白質(zhì)純化手段，直接通過標(biāo)簽與層析介質(zhì)上配體的結(jié)合特性，理論上就可純化出任何帶有標(biāo)簽的目的蛋白。目前國內(nèi)外應(yīng)用較多的親和標(biāo)簽有GST、Flag、MBP、His等，以應(yīng)用最為成熟的His標(biāo)簽為例，雖然很多蛋白的分離都來源于此純化方法，但是這些蛋白的純化條件都是建立在大量摸索經(jīng)驗(yàn)之上的，對于一些初次研究的外源蛋白，前先，研究者需要反復(fù)摸索各緩沖液中鹽離子、咪唑等濃度；其次，以His（多為連續(xù)的6個(gè)組氨酸）為標(biāo)簽，其類似構(gòu)象經(jīng)常出現(xiàn)在宿主雜蛋白中，這直接影響了目的蛋白的純度；最后，考慮到純化的終極目的是獲取天然的目的蛋白，因此使用MBP、GST等標(biāo)簽時(shí)，還需要切除相應(yīng)標(biāo)簽，這極大地加重了純化后的操作。

Profinity eXact系統(tǒng)的作用原理是將外源目的基因插入至表達(dá)載體pPAL7標(biāo)簽下游的多克隆位點(diǎn)，誘導(dǎo)表達(dá)就能產(chǎn)生帶有標(biāo)簽的目的蛋白，固定在純化介質(zhì)上的突變絲氨酸蛋白酶能特異性地與標(biāo)簽結(jié)合，致使目的蛋白被純化介質(zhì)所截留，宿主的本底蛋白則通過漂洗過程去除，最后加入氟離子或疊氮離子就能精準(zhǔn)地誘發(fā)親和標(biāo)簽與目的蛋白之間的剪切，目的蛋白被洗脫，而標(biāo)簽仍結(jié)合在柱上。純化后，通過再生液將標(biāo)簽洗下再生純化介質(zhì)，以備循環(huán)使用。此純化系統(tǒng)將蛋白純化和標(biāo)簽去除高效地整合至一個(gè)過程，從而一步解決了親和純化中，洗脫蛋白轉(zhuǎn)變至目的蛋白的障礙，簡化了純化流程，提高了工作效率。

本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了大小適中，利于檢測活性的egfp蛋白作為外源蛋白，進(jìn)行表達(dá)純化。誘導(dǎo)后的細(xì)菌，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，說明融合標(biāo)簽并不影響egfp蛋白產(chǎn)生綠色熒光的特性。從誘導(dǎo)表達(dá)圖可看出，帶有融合標(biāo)簽的egfp蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在，考慮到可溶性形式較包涵體更接近蛋白的天然特性，因此本研究中取可溶性的融合蛋白進(jìn)行掛柱純化，整個(gè)過程由于綠色熒光蛋白在自然光下存在顏色，因此能夠直接觀測到純化介質(zhì)對融合蛋白的特異性捕獲，以及切割后洗脫下的egfp蛋白。蛋白電泳結(jié)果顯示該純化操作在洗脫液獲得了高純度的egfp，再生液中僅含有標(biāo)簽蛋白。純化獲得的egfp在紫外光下能產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，egfp具有良好的免疫反應(yīng)性，能夠被特異性抗體識別。這些都說明純化獲得的egfp蛋白保留了其天然蛋白的生物學(xué)特性。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們還證實(shí)了該填料經(jīng)再生可反復(fù)使用，且具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

總之，通過我們的實(shí)驗(yàn)說明，Profinity eXact系統(tǒng)作為一種新型親和純化手段，極大地簡化了蛋白純化步驟，縮短了純化時(shí)間，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。