黃永會(huì) 朱英 劉永翔

摘要 從貴州威寧等地采集馬鈴薯病葉樣本，采用試管捕捉反轉(zhuǎn)錄PCR（tubecaptureRTPCR， TCRTPCR）的方法克隆出714 bp的PVX CP基因，編碼237個(gè)氨基酸殘基。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，PVX CP基因可分為兩大類群，推測分離物屬于X³株系，并建議重型花葉也可作為PVX病葉樣本。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯X病毒；外殼蛋白；基因克隆；進(jìn)化分析

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）27-09283-03

Cloning and Phylogenetic Analysis of Potato Virus X CP Gene

HUANG Yonghui1，2， ZHU Ying1，2， LIU Yongxiang1，2

（1.Guizhou Institute of Biotechnology， Guiyang， Guizhou 550006； 2.Guizhou Key Lab for Agricultural Biotechnology， Guiyang， Guizhou 550006）

Abstract Potato leaves with PVX infection symptoms were collected from Guizhou Province including Weining County. A PVX CP gene of 714bp encoding 237 amino acid residues was cloned with the tube capture RTPCR （TCRTPCR） method. Phylogenic analysis revealed that PVX CP genes can be divided into two groups， and the isolate was estimated to be X³strain. Furthermore， We suggested that severe mosaic leaves could also be samples for PVX gene cloning.

Key words Potato virus X （PVX）； Coat protein （CP）； Gene cloning； Phylogenetic analysis

馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）是Potexvirus屬病毒，在全世界馬鈴薯種植區(qū)域都有發(fā)生，通常造成15%的減產(chǎn)，而與其他病毒復(fù)合侵染則會(huì)造成致命損害。 根據(jù)栽培馬鈴薯對(duì)植物抗病基因Nb、Nx 和 Rx的不同反應(yīng)，PVX 通?？梢詣澐譃閄¹、X²、X³和X⁴4個(gè)株系。X¹株系在Nb或Nx存在時(shí)引起超敏反應(yīng)， X²株系只在Nb存在時(shí)引起超敏反應(yīng)，X³株系只在Nx存在時(shí)引起超敏反應(yīng)，X⁴株系在Nb和Nx存在時(shí)均無反應(yīng)，但不能侵染攜帶Rx基因的植株^[1-2]。

PVX基因組有5個(gè)開放閱讀框，外殼蛋白由ORF5編碼，其主要功能定義為在病毒結(jié)構(gòu)中為病毒基因核苷酸提供包被，保護(hù)了病毒基因組信息流失。外殼蛋白在病毒感染植株的傳播中具有重要作用，包括長距離微管運(yùn)輸和細(xì)胞間的移動(dòng)^[3]。而且，外殼蛋白可能參與病毒生活史中其他階段的活動(dòng)，如病毒復(fù)制、介體傳播以及沉默抑制^[4-5]。

筆者以克隆并測序的PVX CP基因序列為原始數(shù)據(jù)，檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中已知PVX CP基因序列，借助生物信息學(xué)軟件對(duì)這些序列進(jìn)行同源比對(duì)和系統(tǒng)樹構(gòu)建，對(duì)PVX CP基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與分組進(jìn)行探討，為PVX病毒控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒樣本。從貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地、貴州威寧縣和甕安縣田間采集花葉癥狀的馬鈴薯病葉，保存于-70 ℃冰箱中。陰性對(duì)照無毒苗由貴州省馬鈴薯工程中心提供。

1.1.2 主要試劑與菌株。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Taq酶、T₄DNA連接酶和pMD18T質(zhì)粒購自大連寶生物公司，DTT 溶液和瓊脂糖購自上海生工生物工程有限公司，Xgal 和IPTG 購自MBI 公司，膠回收試劑盒和DNA Marker購自Tiangen 公司，所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。大腸桿菌DH5a由貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)。

參照Genbank中已登錄的PVX CP基因序列，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增PVX CP基因的一對(duì)引物（PVXf： 5′GAATGTCAGCACCAGCTAGCAC3′和PVXr：5′GCTTATGGTGGTGGGAGAGTGAC3′），由北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司合成。

1.2.2 TCRTPCR方法擴(kuò)增PVX CP基因。參照邱又彬等^[6]的方法。

1.2.3 克隆連接與測序。

采用Tiangen膠回收試劑盒純化700 bp左右的PCR產(chǎn)物，將其與pMD18T連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有氨芐青霉素 （50 mg/ml） 抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)后挑取陽性克隆，將陽性克隆菌液送北京諾塞基因有限公司測序。

1.2.4 序列分析。

從Genbank下載的PVX CP基因與該研究測序獲得的序列用DNAMAN軟件分析并保存，然后用Clustal X 比對(duì)并用Mega 4.0 軟件^[7]建樹，步差值為1 000，用Kimura兩參數(shù)法估計(jì)遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果 共采集到63份病葉樣本，18份來自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)大棚與試驗(yàn)田中，28份來自于威寧縣，17份來自甕安縣。以設(shè)計(jì)合成的特異性引物PVXf 和 PVXr進(jìn)行TCRTPCR擴(kuò)增PVX CP全序列， 結(jié)果表明，來自威寧縣小山鄉(xiāng)的一份樣本中克隆得到1個(gè)目的片段。PCR產(chǎn)物約700 bp，通過膠回收純化后連接pMD18T 載體并測序，得到此產(chǎn)物為714 bp，編碼237個(gè)氨基酸殘基。核苷酸序列和由此推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1。根據(jù)來源與編號(hào)將克隆出PVX CP的樣本分離物命名為XSH2。

除來自英國的X88781、 X88782與X88785 有744個(gè)堿基對(duì)，AF 172559、M31541和其他幾個(gè)分離物只有711個(gè)堿基對(duì)外，其他所有PVX CP 基因都含有714個(gè)堿基對(duì)，編碼237個(gè)氨基酸殘基。 XSH2與GenBank中其他PVX分離物的CP核苷酸序列同源性在78.6% ～ 98.8% ，氨基酸序列同源性在86.9% ～100%。 由圖2可知，PVX CP 基因劃分為一大一小2個(gè)群組。 群組I聚集了45個(gè)來自世界不同地域的分離物，群組II聚集了來自南美的8個(gè)分離物和來自英國的4個(gè)分離物。包括XSH2 在內(nèi)的來自我國的分離物分散到群組I中的各個(gè)亞組中，但相互之間進(jìn)化距離都很近。據(jù)世界糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)顯示，馬鈴薯起源于南美，然后被引入歐洲、北美和前蘇聯(lián)的一些國家種植，但其在亞洲、非洲和拉丁美洲的生產(chǎn)和需求自1990年以來迅速增長。PVX CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹揭示出由于馬鈴薯在全世界的傳播種植，在馬鈴薯傳播的同時(shí)，以塊莖進(jìn)行無性繁殖的特性也導(dǎo)致了病毒病在全球范圍內(nèi)的廣泛傳播。

從表1與圖2可以看出，XSH2 CP與X³株系的來自荷蘭的D00344具有100%的氨基酸同源性，在系統(tǒng)進(jìn)化上距離也很近，因此可以推測分離物XSH2屬于X³株系^[8]。 姚東校等^[9]研究表明在貴州威寧分離得到的另一個(gè)PVX分離物屬于X³株系，說明同一地域的馬鈴薯具有共同的引種來源， 因此其攜帶的病毒同源性很高，變異度很小。

3 結(jié)論與討論

PVX感染所引起的癥狀取決于PVX株系和馬鈴薯品種， 一般情況下是肉眼觀察不到的，所以也被稱為潛隱病毒。幼嫩植株感染初期可見的癥狀主要是輕微的花葉癥狀，但此癥狀會(huì)隨著溫度的上升而變得不明顯， 16～20 ℃的多云天氣有利于癥狀的形成。 目前關(guān)于PVX病葉樣品采集尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，一般以輕型花葉為主。PVX感染癥狀的多變性使得病葉樣本的采集實(shí)施較困難。該研究共采集了63份病葉樣本，主要癥狀依據(jù)是輕型花葉，但只有一個(gè)樣本成功檢測和克隆得到了PVX CP，意外的是這個(gè)樣本恰好表現(xiàn)嚴(yán)重花葉癥狀。 據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，運(yùn)用血清學(xué)方法檢測貴州馬鈴薯發(fā)現(xiàn)PVX發(fā)生率較低，不到10%^[9-10]，因此如果想得到PVX分離物，選擇適合的病葉樣本很重要。該研究發(fā)現(xiàn)重型花葉癥狀的病葉也可用于PVX的分離與基因克隆，杜志游等^[11]研究表明，在湖南零星種植的地區(qū)一株表現(xiàn)重型花葉的馬鈴薯上獲得PVX分離物， 推測可能是因?yàn)镻VX與馬鈴薯Y病毒 （Potato virus Y， PVY） 等經(jīng)常共同侵染從而表現(xiàn)嚴(yán)重癥狀。

病毒株系的鑒定是控制病毒的基礎(chǔ)工作。PVX的分類依賴于病毒對(duì)于抗性基因Nb、Nx 和 Rx的反應(yīng)。研究表明PVX CP基因?qū)τ诓《?寄主互作非常重要，CP基因中的第121和127個(gè)密碼子揭示了馬鈴薯抗性突破 （resistancebreaking） 的主要決定因子^[12]，即PVX CP基因在PVX株系分類中發(fā)揮重要作用，因此通過獲得CP基因序列進(jìn)行病毒鑒定，是一種常見的手段。該研究對(duì)分離自貴州的PVX CP進(jìn)行了序列測定與進(jìn)化分析，推測其屬于X³株系，有助于生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)PVX開展針對(duì)性防控，對(duì)PVX病葉樣本采集也提出了建議，認(rèn)為重型花葉也可以考慮作為PVX分離物的樣本。

參考文獻(xiàn)

[1]

COCKERHAM G.Strains of potato virus X[C]//Proceedings of the Second Conference of Potato Virus Disease.LisseWageningen，1954：89-92.

[2] COCKERHAM G.Genetical studies on resistance to potato virus X and Y[J].Heredity，1970，25：309-348.

[3] FEDORKIN O N， SOLOVYEV A G， YELINA N E，et al.Cell-to-cell movement of potato virus X involves distinct functions of the coat protein[J].J Gen Virol，2001，82：449-458.

[4] THOMAS C L， LEH V， LEDERER C，et al.Turnip crinkle virus coat protein mediates suppression of RNA silencing in Nicotiana benthamiana[J].Virology，2003，306：33-41.

[5] QU F， REN T，MORRIS T J.The coat protein of turnip crinkle virus suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step[J].J Virol， 2003， 77（1）：511-522.

[6] 邱又彬，陶剛，黃永會(huì)，等.TCRT—PCR技術(shù)在馬鈴薯病毒檢測及其基因克隆上的應(yīng)用[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009， 22（2）：329-331.

[7] TAMURA K， DUDLEY J， NEI M，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis （MEGA） software version 4.0[J].Mol Biol Evol， 2007， 24：1596-1599.

[8] HUISMAN M J， LINTHORST H J M， BOL J F，et al.The complete nucleotide sequence of Potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plusstranded RNA viruses[J].J Gen Virol，1988， 69：1789-1798.

[9] 姚東校，洪鯤 楊立昌，等.馬鈴薯X病毒貴州分離物的分子鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（13）：139-141.

[10] 顏謙，黃萍，宋吉軒，等.貴州不同海拔地區(qū)馬鈴薯病毒病初步調(diào)查及檢測鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（29）：14262-14263.

[11] 杜志游，陳集雙.馬鈴薯x病毒湖南分離物的鑒定與分組研究[J].中國病毒學(xué)，2003，18（2）：119-123.

[12] GOULDEN M， KOHM B， CRUZ S S，et al.A feature of the coat protein of potato virus X affects both induced virus resistance in potato and viral fitness[J].Virology， 1993， 197：293-302.