符群 徐明慧 高小棠 王振宇

摘要

[目的] 研究紅松種鱗多酚對癌細胞體外增殖的抑制作用。[方法]分別采用不同濃度紅松多酚提取液對人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y、人肺腺癌細胞株A549、人皮膚癌細胞株A375、人肝癌細胞株HepG2、人卵巢癌細胞株SKOV3這5種常見的腫瘤細胞進行試驗，采用MTT法檢測體外細胞增殖抑制率。[結(jié)果]紅松多酚提取物對SH-SY5Y、HepG2、SKOV3的抑制作用不明顯，而對A549、A375均有抑制效果。[結(jié)論]在紅松多酚提取液固形物含量為0.4 mg/ml時，其對A549細胞抑制效果最佳，在該濃度下，紅松多酚提取液對人肺腺癌細胞A549的抑制率可達到55%。

關(guān)鍵詞 紅松；多酚；抗腫瘤；MTT

中圖分類號 S791.26 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）27-0925-03

Study on the Antitumor Properties of Korean Pine Scale Polyphenols

FU Qun¹， XU Minghui¹， GAO Xiaotang¹， WANG Zhenyu2*

（1. School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract [Objective] To study inhibition effect of Korean pine scale polyphenols on cancer cell in vitro proliferation. [Method] Using different concentration of Korean pine scale polyphenols extract， experiments were conducted on human bone marrow neuroblastoma cell line SH SY5Y and A549 lung adenocarcinoma cancer cells and human skin cancer cell lines A375， human liver cancer cell line HepG2， human ovarian cancer cell lines SKOV3. MTT was used to detect the inhibition rate on in vitro cell proliferation. [Result] Korean pine polyphenols extracts have no obvious inhibition effect on SHSY6Y， HepG2， SKOV3， while have inhibition effect on A549 and A375. [Conclusion] When the solid content in Korean pine polyphenols extracts is 0.4 mg/ml， the inhibition effect on A549 can up to 55%.

Key words Korean pine； Polyphenols； Antitumor； MTT

腫瘤（Tumor） 是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。由于腫瘤的產(chǎn)物（包括異位激素產(chǎn)生）或異常免疫反應(yīng)（包括交叉免疫、自身免疫和免疫復(fù)合物沉積等）引起內(nèi)分泌、神經(jīng)、造血、消化、骨關(guān)節(jié)、腎臟、皮膚等系統(tǒng)發(fā)生病變，引起相應(yīng)的臨床癥狀，稱為副腫瘤綜合癥狀。腫瘤是細胞異常增生性疾病，嚴(yán)重危及人類的生命，尤其是癌腫。長期以來，人們?yōu)閷ふ野踩行У目拱┧幬铮瑢Υ罅恐兴幉倪M行抗癌活性篩選，目前已發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)多酚類可以抑制腫瘤細胞的生長^[1]。

紅松又名果松，屬于松科植物，國家Ⅱ級重點保護野生植物，主要分布在我國東北長白山到小興安嶺一帶，紅松材質(zhì)輕軟，不易變形，耐腐能力強。目前，人們從松科植物中已分離出揮發(fā)性成分、三萜、二萜、木質(zhì)素、二苯乙烯和黃酮等類型化合物，主要有抗真菌、抗細菌、抗腫瘤、抗HIV、抗氧化、趨避昆蟲等活性，部分化合物可作為食品添加劑^[2]。除此之外，在紅松中還能提取出許多酚類物質(zhì)，因此紅松除具有使用價值外，還在保健、醫(yī)學(xué)、藥用等方面有巨大的開發(fā)潛力。諸多研究表明，針形樹種的種皮、樹皮、種鱗等各個不同部位皆含有多酚類化合物，并且多為傳統(tǒng)樹木開發(fā)利用業(yè)中的廢棄部分，這造成了資源的極大浪費。由于松多酚特有的超強活性，使得其質(zhì)量評價成為重要的研究課題，建立有效的評價系統(tǒng)必將為其高效利用提供堅實的保障。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紅松種鱗采自長白山；人肺腺癌細胞株A549、人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y、人皮膚癌細胞株A375、人肝癌細胞株HepG-2、人卵巢癌細胞株SKOV3均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供；高糖DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶-EDTA消化液，購自北京索萊寶科技有限公司（Beijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd）。

1.2 研究方法

1.2.1

紅松多酚的制備。

稱取200 g干燥紅松種鱗粉末于燒杯中，以1∶20比例（m/V）加入60%乙醇4 000 ml。在50 ℃、2 400 Hz條件下超聲1 h，將燒杯中提取液和殘渣一同過紗布，保留提取液，將殘渣放入燒杯中，繼續(xù)以1∶20比例（m/V）加入60%乙醇4 000 ml，在50 ℃、2 400 Hz條件下超聲1 h。將2次得到的紅松種鱗多酚提取液合并，在45 ℃的條件下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。將預(yù)處理活化后的AB-8樹脂裝柱，層析法純化多酚提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，收集多酚純化物（純度達45%）。采用Folin-Ciocalteu法^[3]測定多酚含量。

1.2.2

細胞培養(yǎng)。

將腫瘤細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)^[4-6]。

1.2.3

紅松多酚對腫瘤細胞抑制率的測定。采用MTT比色法檢測細胞增殖抑制率^[7-9]。取對數(shù)生長期的A549細胞，用適量0.25%的EDTA-胰蛋白酶將貼壁的細胞充分消化，再用新鮮的DMEM細胞培養(yǎng)液制成5×10⁴個/ml的細胞懸液，按每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中^[10]，空白列用PBS代替細胞懸液，將96孔培養(yǎng)板放置于37 ℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，分別加入5 μl終濃度為1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/ml的多酚純化液，每濃度設(shè)6個重復(fù)，另外設(shè)置1個對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），培養(yǎng)4 h后取出。吸棄各孔中的上清液，并向每孔加入200 μl的二甲基亞砜（DMSO）。在恒速振蕩器上振搖20 min，用酶標(biāo)免疫測定儀在490 nm波長下測定各孔的吸光值（OD）。按公式（Ⅰ）計算紅松多酚純化液對腫瘤細胞的生長抑制率。

由圖3可知，紅松多酚提取物在高濃度（1.0，0.9，0.8，0.7 mg/ml）時對A375細胞的生長起抑制作用。利用SPSS中的ANOVA進行組間顯著性統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，紅松多酚提取物濃度為1.0，0.9，0.8，0.7 mg/ml時，其對A375的抑制率與對照組相比均有極顯著差異（P<0.01），而在低濃度（06，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 mg/ml）時對A375細胞的生長起促進作用。

雖然高濃度的紅松多酚提取物能夠抑制A375細胞的生長，但抑制率并不高，紅松多酚提取物的濃度為0.9 mg/ml時，其對A375細胞的抑制率僅達到17.15%。利用SPSS中的ANOVA進行組間顯著性統(tǒng)計分析，1.0，0.9，0.8，0.7 mg/ml各濃度間抑制效果差異不顯著。

通過計算，可以得出紅松多酚提取物對A375細胞的IC50為12.282 mg/ml。說明當(dāng)作用于A375細胞的紅松多酚提取物濃度為12.282 mg/ml時，A375細胞死亡數(shù)量達到50%，即有1/2的A375細胞在紅松多酚提取物的作用下死亡。但A375腫瘤細胞的IC50值與A549腫瘤細胞的IC50數(shù)值相比大很多，因此可以認為A549腫瘤細胞對紅松多酚更為敏感。

2.4 紅松多酚對HepG-2細胞增殖的影響

在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選取濃度范圍為0.1～1.0 mg/ml多酚提取液，對其進行HepG-2腫瘤細胞增殖的抑制試驗，該作用劑量范圍內(nèi)，多酚提取液對HepG-2細胞的抑制效果如圖4所示。

由圖5可知，紅松多酚提取物對SKOV3細胞的生長起

到促進作用，低濃度的紅松多酚提取物對SKOV3細胞生長

促進作用相對較弱，而高濃度的紅松多酚提取物對SKOV3細胞有相對較強的促進生長作用，并且這種促進作用與紅松

多酚提取物濃度存在一定的劑效關(guān)系，即隨著紅松多酚提取物濃度的增加，紅松多酚對SKOV3細胞生長的促進作用越顯著。推測可能是SKOV3細胞在10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO₂的培養(yǎng)條件下，紅松多酚給予其營養(yǎng)，更有利于SKOV3細胞的生長。

3 結(jié)論

（1）通過比較5種細胞的平均OD值和細胞抑制率可以發(fā)現(xiàn)，紅松種鱗多酚提取物對人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y、人肝癌細胞HepG-2和人卵巢癌細胞SKOV3的抑制作用不明顯，而在一定濃度下對人肺腺癌細胞A549和人皮膚癌細胞A375均有抑制效果。比較二者與紅松種鱗多酚提取物作用時間24 h的IC50發(fā)現(xiàn)，人肺腺癌細胞A549的IC50為0.418 mg/ml，而人皮膚癌細胞A375的IC50為12.282 mg/ml。A549細胞的IC50遠遠低于A375細胞的IC50，可見人肺腺癌細胞A549比人皮膚癌細胞A375在紅松種鱗多酚輔助治療癌癥方面具有更實際的研究意義。

（2）人肺腺癌細胞A549在紅松種鱗多酚提取液固形物含量為0.4 mg/ml時，平均OD值最低，細胞抑制率最高。在該濃度下，紅松多酚提取液對人肺腺癌細胞A549的抑制率能達到55%以上。

參考文獻

[1]

吳琦瑋.中藥有效成分靛玉紅對腫瘤細胞抑制作用的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[2] 楊佳倩.紅松和馬尾松化學(xué)成分研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2008.

[3] SINGLETON V L，ORTHOFER R，LAMUELA-RAVENTOS R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent[J].Methods in Enzymology，1999，299：152-178.

[4] 劉西嶺，辛華，譚玲玲.北沙參水提法不同提取物體外抗腫瘤的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（20）：9481-9482.

[5] 全吉淑，程 靜，劉春彥，等.大豆異黃酮聯(lián)合順鉑對A549 細胞增殖和凋亡的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報，2011，33（5）：506-509.

[6] 李健，韓增勝，李青旺.龍葵多糖抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（33）：14589-14590.

[7] 丁霞，高思國，李冠業(yè)，等.龍葵不同提取部位體外抗腫瘤作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（5）：1244-1246.

[8] 趙欣，王強.普洱茶粗提物的體外抗癌及體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2013，35（6）：563-566.

[9] 王翠平.籽瓜抗氧化及抗腫瘤活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（29）：17833-17836.

[10] 黃蘭蘭，石國慶，盧春霞.影響動物細胞體外培養(yǎng)因素[J].黑龍江動物繁殖，2005，13（4）：16-17.