李力燕等

【摘要】目的：探討SD大鼠肝纖維化后肝組織腫瘤壞死因子α的表達(dá)和變化，以及三七皂苷R1對肝纖維化的保護(hù)作用。方法：72只健康雄性SD大鼠分為對照組（A組）、NDMA組（B組）和三七皂苷R1組（C組），再按不同時間點分為1、2、4周3個亞組，每個亞組8只動物。B組采用二甲基亞硝胺（NDMA）腹腔注射，C組同時靜脈注射三七皂苷R1，劑量為100 mg/kg，A組注射等量的生理鹽水。在各組的不同時間點取肝組織約100 mg，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及ELISA技術(shù)檢測肝組織中TNF-α 蛋白及mRNA的表達(dá)及變化。結(jié)果：TNF-α 蛋白及mRNA在各組中均有表達(dá)。A組各時間點比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在B組中，隨著損傷時間的延長，TNF-α 蛋白及mRNA的表達(dá)逐漸上調(diào)（P<0.05），且各時間點與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而C組TNF-α蛋白及mRNA在各時間點均較B組表達(dá)下調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：1、TNF-α參與了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程，且隨損傷的逐漸加重，表達(dá)逐漸越高。2、三七皂苷R1可降低肝組織中TNF-α的表達(dá)，減輕肝細(xì)胞的纖維化，發(fā)揮保護(hù)肝組織損傷的作用。

【關(guān)鍵詞】 三七皂苷R1；肝纖維化；大鼠；腫瘤壞死因子α

【中圖分類號】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）01-0011-01

肝纖維化（Hepatic fibrosis）是由于多種因素導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，是肝硬化的早期經(jīng)過階段，病毒性肝炎特別是乙型肝炎是其主要的致病因素之一。近年來，應(yīng)用中藥治療乙型肝炎有較多的研究[1]。本實驗采用大鼠肝纖維化模型，采用ELISA及RT-PCR技術(shù)檢測肝組織中TNF-α 蛋白和mRNA的表達(dá)和變化，并探討三七皂苷R1對肝纖維化的保護(hù)作用，可為臨床治療乙肝所導(dǎo)致的肝纖維化提供進(jìn)一步的理論依據(jù)，為臨床尋找有效的藥物提供進(jìn)一步的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 所需的試劑

1.2 動物及其分組

72只健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物科，重180-200g，分為對照組（A組）、NDMA組（B組）和三七皂苷R1組（C組），再按不同時間點分為1、2、4周3個亞組，每個亞組8只動物。所有大鼠均在同樣的條件下飼養(yǎng)，定時給予飼料和水，以確保實驗結(jié)果的可靠，盡量降低誤差。

1.3 動物模型的制備及取材

NDMA組采用NDMA注射大鼠腹腔制作肝纖維化模型。方法為將NDMA溶解于生理鹽水使其最終濃度為0.5%，按2ml/kg的劑量腹腔注射，每周前3天每天1次，連續(xù)4周建立肝纖維化模型。三七皂苷R1組于第4周采用股靜脈注入三七皂苷R1（以0.9%生理鹽水稀釋為5 mg/ml）1ml。對照組僅腹腔注射等量的生理鹽水。所有動物于不同時間點取肝組織約100mg，裝入盛有預(yù)冷的TRIZOL 1 ml的EP管中，勻漿后至-80℃冰箱中備用。另取部分用于ELISA的實驗。

1.4 免疫比濁法

按試劑盒說明書檢測各組血清中TNF-α蛋白的含量。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增目的基因

3.1 TNF-α與肝纖維化的關(guān)系

TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對肝纖維化的發(fā)生有著促進(jìn)的作用，當(dāng)其過度表達(dá)時，可對組織產(chǎn)生損傷，使組織纖維化[3]。另外，TNF的表達(dá)水平與肝組織的炎癥程度相一致，提示其可作為炎癥介質(zhì)而參與了肝纖維化的形成。陳曉紅等[4]對慢性病毒性肝炎及肝硬化患者肝穿取得的肝組織中發(fā)現(xiàn)，患者血清中TNF-α升高，且與肝纖維化程度成正相關(guān)。裴豪等[5]在對急、慢性肝病血清TNF-α表達(dá)水平的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α的表達(dá)而抑制HSC的活化和FN的分泌集聚，最終保護(hù)了受損的肝組織[6]。由此可見，在肝纖維化的過程中，TNF-α起著中心的作用，不僅可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，還可使間質(zhì)細(xì)胞增殖分化和ECM的合成增強，進(jìn)而使肝組織損傷得以修復(fù)[7]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在NDMA組中TNF-α的表達(dá)逐漸升高，且各時間點的表達(dá)也高于相應(yīng)時間點對照組的表達(dá)。

3.2 三七皂苷R1液可通過降低TNF-α的表達(dá)來減慢肝纖維化的進(jìn)程

三七（Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen）為五加科植物，干燥的根入藥。味甘、微苦，性溫，歸肝、胃、心、小腸經(jīng)，具有止血、散瘀、消腫、止痛、補虛、強壯等功效，含量最高的為三七總皂苷（PNS）即人參皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1[8]。研究表明，PNS不僅能抑制I、Ⅲ型膠原合成，還對炎癥產(chǎn)生的細(xì)胞因子、成纖維細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用[9]。三七皂苷R1具有改善機體微循環(huán)、保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等功能，還能明顯降低肝纖維化大鼠血清中PC-III、HA、LN的含量，抑制肝纖維化大鼠轉(zhuǎn)氨酶的升高，減輕肝纖維化程度[10]。PNS可顯著降低肝纖維化小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶及NO水平，增加肝臟白蛋白的合成，減輕肝纖維化程度[11]。

本實驗結(jié)果顯示，三七皂苷R1可降低肝組織中的TNF-α的含量，說明三七皂苷R1可以起到治療肝病及防治肝纖維化有明顯效果。本實驗僅對三七皂苷R1對肝纖維化大鼠肝組織中TNF-α基因的表達(dá)及變化進(jìn)行了研究，表明TNF-α可能是三七抗肝纖維化的因子之一，仍待進(jìn)一步的研究。