李慧玲 劉祖艷 趙敏

摘要 [目的]對重組畢赤酵母菌表達(dá)β甘露聚糖酶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。[方法]以重組畢赤酵母GS115為研究對象，通過單因素試驗(yàn)確定最佳產(chǎn)酶條件，并采用響應(yīng)面試驗(yàn)確定3個(gè)因素的最佳水平。[結(jié)果]最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)pH 6.5，搖床轉(zhuǎn)速210 r/min，培養(yǎng)基裝液量100 ml。響應(yīng)面試驗(yàn)確定3個(gè)因素即裝液量、甲醇添加量和pH最佳值分別為103.18 ml、1.77%和6.69；在此條件下，β甘露聚糖酶的活力最大值為4 917.5 U/ml。[結(jié)論]驗(yàn)證試驗(yàn)證明模型預(yù)測值準(zhǔn)確、可靠，為重組畢赤酵母菌的合理開發(fā)利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 重組畢赤酵母；β甘露聚糖酶；響應(yīng)面

中圖分類號 S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03153-03

Abstract [Objective] To optimize the induction conditions of the recombinant Pichia pastoris βmannanase. [Method] With recombinant Pichia pastoris GS115 as study object， the optimal enzyme producing conditions and three factors optimal level were determined by single factor experiment and response surface experiment respectively. [Result] The optimum enzyme producing conditions are： temperature 28 ℃， pH 6.5， rotating speed 210 r/min， volume of medium 100 ml. Response surface methodology was used to optimize the above three factors（volume of medium， methanol concentration， pH of medium）with the optimum value 103.18 ml， 1.77%， 6.69， respectively. The βmannanase activity would reach the highest value（4 917.5 U/ml） under the optimized fermentation conditions. [Conclusion] The predicted values from the response surface methodology were proved to be correct and reliable by verification test， which will provide a reference for appropriate utilization and development of recombinant Pichia pastoris.

Key words Recombinant Pichia pastoris； βmannanase； Response surface methodology

β1，4D甘露聚糖酶（β1，4Dmannan mannanohydrolase，EC 3.2.l.78），簡稱為β甘露聚糖酶（βmannanase）屬于半纖維素酶類，可以斷裂β1，4D甘露糖苷鍵[12]。β甘露聚糖酶廣泛應(yīng)用于紙漿、飼料和鉆井等生產(chǎn)領(lǐng)域[3-6]。

β甘露聚糖酶存在于細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌和植物中[6]。來自于細(xì)菌的β甘露聚糖酶已被分離得到，如Bacillus subtilis WY34、Cellulosimicrobium sp.strain HY13、Sphingomonas strain等[7-9]?？寺〖?xì)菌的β甘露聚糖酶并且高效異源表達(dá)有助于滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母成功作為高水平表達(dá)異源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)[10-11]。

筆者為了使構(gòu)建的重組畢赤酵母表達(dá)β甘露聚糖酶潛力充分發(fā)揮出來，優(yōu)化其發(fā)酵過程，以獲得較高的產(chǎn)物濃度。研究選用裝液量、甲醇添加量和pH值3個(gè)關(guān)鍵因素為自變量，以重組β甘露聚糖酶的酶活力為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化并確定最佳方案，以期為重組畢赤酵母的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。分泌表達(dá)β甘露聚糖酶的重組畢赤酵母菌Man12，由東北林業(yè)大學(xué)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑。培養(yǎng)基的配制方法參見Invitrogen公司《畢赤酵母操作手冊》。

1.2 方法

1.2.1 菌株的誘導(dǎo)表達(dá)。取-80 ℃冰箱保存的甘油菌接種于YPD培養(yǎng)基中，劃線活化，28 ℃倒置培養(yǎng)。挑取菌株接種至BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h至OD600=2～6，離心收集菌體，用BMMY重懸菌體，使OD600=1.0左右；取菌液繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，每隔24 h加入無水甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)72 h，測定酶活性。

1.2.2 粗酶液的制備。取誘導(dǎo)表達(dá)Man12菌株培養(yǎng)液，離心后上清液即為粗酶液。

1.2.3 重組β甘露聚糖酶活力測定方法。采用改進(jìn)的3，5-二硝基水楊酸法（DNS方法）測定酶活力[12]，利用比色法測定酶解后還原產(chǎn)物的生成量，以表示酶的活力。酶活力定義：在一定溫度和pH下，以每分鐘生成相當(dāng)于1 μmol D甘露糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位（IU）。

1.2.4 培養(yǎng)溫度對重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。重組畢赤酵母菌分別在24、26、28、30和32 ℃條件下培養(yǎng)，以確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.5 甲醇濃度對重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。在BMGY培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%和2.50%的甲醇，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后測定酶的活力，以確定甲醇的最佳添加量。

1.2.6 不同pH值對重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。通過添加0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液使培養(yǎng)基的pH值分別達(dá)到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的培養(yǎng)基，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72 h后測定酶的活力，以獲得發(fā)酵培養(yǎng)最佳pH值。

1.2.7 搖床轉(zhuǎn)速對重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。重組畢赤酵母菌搖床培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為180、190、200、210、220和230 r/min，進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.8 培養(yǎng)基裝液量對重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。分別將50、70、100、110、120和130 ml經(jīng)BMMY重懸的菌液裝入500 ml三角瓶中培養(yǎng)，測定酶活，獲得最佳裝液量。

1.2.9 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件。利用DesignExpert軟件進(jìn)行裝液量、甲醇添加量和培養(yǎng)基pH3個(gè)條件的響應(yīng)面分析，以β-甘露聚糖酶酶活力為響應(yīng)值。

隨著裝液量和pH的增加，酶活變化是先升高后降低。方差分析表明，裝液量和pH交互作用不顯著（P>0.05）。圖7表明，甲醇加入量是1.5%時(shí)，隨著裝液量的增加，酶活逐漸降低，因?yàn)閾u瓶培養(yǎng)時(shí)，液體過多，酵母菌通氣不暢，影響其正常生長，所以酶活下降。當(dāng)甲醇加入量是達(dá)2.1%以上時(shí)，隨著裝液量的增加，酶活變化不大，推測原因是甲醇誘導(dǎo)外源基因大量表達(dá)，所以產(chǎn)酶較多。方差分析表明，甲醇加入量和裝液量交互作用極顯著（P<0.01）。圖8表明，當(dāng)甲醇添加量為1.5%時(shí)，隨著pH值的增加，酶活先升高后降低；當(dāng)甲醇添加量是2.3%時(shí)，趨勢相同。畢赤酵母是成功的表達(dá)系統(tǒng)，已得到廣泛應(yīng)用。不同畢赤酵母產(chǎn)外源

蛋白的培養(yǎng)條件有一定差別，需要后期優(yōu)化其發(fā)酵條件，以獲得更多的表達(dá)產(chǎn)物。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化重組酵母菌搖瓶培養(yǎng)條件，最終獲得產(chǎn)酶最優(yōu)條件為：培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速是210 r/min，裝液量是103.18 ml（500 ml三角瓶）、甲醇加入量為1.77%、pH是6.69，為重組畢赤酵母的中試發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]

MCCLEARY B V.βmannanase[J].Methods in Enzymology，1988，160：596-610.

[2] SCHOMBUG D，SALZMANN M.Enzyme Handbook[M].Berlin：SpringerVerlay Berlin Heideberg，1991，1-5.

[3] BENECH R O，LI X，PATTON D，et al.Recombinant expression，characterization，and pulp pr ebleaching property of a Phanerochaete chrysosporium endoβ1，4mannanase[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，41：740-747.

[4] WU G，BRYANT M M，VOITLE R A，et al.Effects of βmannanase in cornsoy diets on commercial leghorns in secondcycle hens[J].Poultry Science，2005，84：894-897.

[5] DHAWAN S，KAUR J.Microbial mannanases：an overview of production and applications[J].Crit Rev Biotechnol，2007，27：197-216.

[6] MOREIRA L R S，F(xiàn)ILHO E X F.An overview of mannan structure and mannandegrading enzyme systems[J].Appl Microbiol Biotechnol，2008，79：165-178.

[7] JIANG Z Q，WEI Y，LI D Y，et al.Highlevel production，purification and characterization of a thermostable βmannanase from the newly isolated Bacillus subtilis WY34[J].Carbohydrate Polymers，2006，66：88-96.

[8] KIM D Y，HAM S J，LEE H J，et al.Cloning and characterization of a modular GH5 β1，4mannanase with high specific activity from the fibrolytic bacterium Cellulosimicrobium sp.strain HY13[J].Bioresource Technology，2011，19：9185-9192.

[9] ZHOU J P，ZHANG R，GAO Y J，et al.Novel lowtemperatureactive，salttolerant and proteasesresistant endo1，4βmannanase from a new Sphingomonas strain[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，5：568-574.

[10] DALY R，HEARN M T.Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris： a useful experimental tool in protein engineering and production[J].J Mol Recognit，2005，18：119-138.

[11] MACAULEYPATRICK S，F(xiàn)AZENDA M L，MCNEIL B，et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J].Yeast，2005，22：249-270.

[12] MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].Anal Chem，1959，31：426-428.

[13] 韓雪清，劉湘濤，尹雙輝.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)[J].微生物學(xué)雜志，2003，23（4）：35-40.