姜經(jīng)航郭哲楊浩潔楊富權(quán)鮑思揚(yáng)黎樂群楊日榮向邦德

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室

基礎(chǔ)研究

肝細(xì)胞癌根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)microRNAs的篩選

姜經(jīng)航1郭哲1楊浩潔1楊富權(quán)1鮑思揚(yáng)1黎樂群1楊日榮2向邦德1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室

目的 篩選與肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)的microRNAs。方法 收集10例HCC患者肝臟組織標(biāo)本，其中早期復(fù)發(fā)組5例，非早期復(fù)發(fā)組5例，以及正常肝臟組織標(biāo)本4例。利用microRNA基因芯片技術(shù)檢測3組肝臟組織標(biāo)本中microRNAs的表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的microRNAs。結(jié)果 早期復(fù)發(fā)組與正常組相比，miR-21-3p、miR-21-5p、miR-222-3p、miR-3182、miR-3651、miR-3654、miR-4451、miR-4633-5p、miR-720的表達(dá)均上調(diào)，miR-4525的表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；非早期復(fù)發(fā)組與正常組相比，miR-106b-5p、miR-4451、miR-3651、miR-93-5p的表達(dá)均上調(diào)，miR-451a、miR-3692-5p的表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 microRNAs的表達(dá)與HCC患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)有關(guān)，檢測患者肝臟組織中microRNAs的表達(dá)水平可能有助于監(jiān)測HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)。

肝腫瘤；microRNAs；基因芯片；復(fù)發(fā)

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）由于發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，早期診斷困難，預(yù)后差，是導(dǎo)致患者因癌死亡的主要原因之一［1］。目前手術(shù)切除仍然是治療HCC最有效的方法，然而術(shù)后2年復(fù)發(fā)率高達(dá)45%［2］。因此篩選出HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)病例中差異表達(dá)的基因，研究與HCC早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)的分子機(jī)制十分必要。近年來，有研究表明microRNA（miR）在腫瘤凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著類似癌基因和抑癌基因的作用［3］。本研究采用microRAN芯片技術(shù)篩選出HCC早期復(fù)發(fā)組、非早期復(fù)發(fā)組和正常組肝臟組織中差異表達(dá)的microRNAs，為進(jìn)一步研究microRNAs在HCC早期復(fù)發(fā)中的分子機(jī)制提供新的線索。

1 資料與方法

表1 納入研究患者的基線資料

1.1 臨床標(biāo)本

10例HCC肝臟組織標(biāo)本均來自我院行根治性肝切除術(shù)的患者，術(shù)后病理診斷為HCC。其中術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)組5例（早期復(fù)發(fā)組）和2年內(nèi)未復(fù)發(fā)組5例（非早期復(fù)發(fā)組），具體入組標(biāo)準(zhǔn)為：⑴單結(jié)節(jié)肝癌，腫瘤直徑<5.0 cm；⑵肝功能Child-Pugh A級；⑶手術(shù)切緣＞1.0 cm；⑷術(shù)后影像學(xué)檢查未見殘留腫瘤、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移以及門靜脈癌栓；⑸術(shù)前AFP陽性者術(shù)后隨訪2個月內(nèi)血清AFP降至正常。正常組為4例正常肝臟組織（肝血管瘤標(biāo)本周圍的正常肝臟組織）。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。入組患者一般資料詳見表1。

（續(xù)表）

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 利用液氮研磨早期復(fù)發(fā)組、非早期復(fù)發(fā)組和正常組肝臟組織標(biāo)本，采用Trizol試劑（Invitrogen公司）一步法提取3組肝臟組織的總RNA。采用NANODROP 2000（Thermo公司）核酸微量檢測儀檢測總RNA的純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.2.2 microRNAs的檢測 取2.5 μg總RNA用于檢測早期復(fù)發(fā)組、非早期復(fù)發(fā)組和正常組肝臟組織中差異表達(dá)的microRNAs。microRNA芯片采用Human miRNA OneArray（Phalanx Biotech Group提供）檢測與人類相關(guān)的microRNAs。具體實(shí)驗(yàn)過程由Phalanx Biotech Group實(shí)施。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由Phalanx Biotech Group分析處理，其中以P<0.05為依據(jù)確定差異表達(dá)的microRNAs，同時以log2|Ratio|≥0.8確定上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的microRNAs。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的純度和濃度

早期復(fù)發(fā)組、非早期復(fù)發(fā)組和正常組中總RNA吸光度A260/A280均在1.8~2.0之間，提示總RNA的純度高，無DNA和蛋白質(zhì)污染。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，且28S/18S條帶灰度比值>1.5，提示總RNA的完整性好。見圖1?？俁NA純度和完整性檢測提示總RNA質(zhì)量好，可以進(jìn)行后續(xù)基因芯片實(shí)驗(yàn)。

2.2 早期復(fù)發(fā)組、非早期復(fù)發(fā)組和正常組中microRNAs的表達(dá)

2.2.1 早期復(fù)發(fā)組與正常組中各種類型microRNAs相比，篩選出差異表達(dá)的基因，如圖2。發(fā)現(xiàn)有9個microRNAs的表達(dá)上調(diào)，分別為 miR-21-5p、miR-3651、miR-3182、miR-21-3p、miR-3654、miR-4633-5p、miR-4451、miR-222-3p和miR-720，miR-4525的表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。見表2。

2.2.2 非早期復(fù)發(fā)組與正常組中microRNAs相比較，篩選出差異表達(dá)基因，如圖3。發(fā)現(xiàn)4個microRNAs的表達(dá)上調(diào)，分別為miR-106b-5p、miR-4451、miR-3651和miR-93-5p，2個microRNAs的表達(dá)下調(diào)，分別為miR-451a、miR-3692-5p（P<0.05）。見表3。

2.2.3 早期復(fù)發(fā)組與非早期復(fù)發(fā)組中各種類型microRNAs相比，篩選出差異表達(dá)的基因，如圖4。均無表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的microRNAs（P>0.05）。

圖1 總RNA 1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 早期復(fù)發(fā)組與正常組比較差異表達(dá)的microRNAs

表2 早期復(fù)發(fā)組與正常組中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的microRNAs

表3 非早期復(fù)發(fā)組與正常組中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的microRNAs

圖3 非早期復(fù)發(fā)組與正常組比較差異表達(dá)的microRNAs

圖4 早期復(fù)發(fā)組與非早期復(fù)發(fā)組比較差異表達(dá)的microRNAs

3 討論

microRNA異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，例如肝細(xì)胞癌、乳腺癌和胰腺癌等［4］。microRNA通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、凋亡、增殖和遷移，從而影響HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后［5］。同時HCC術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞中存在少數(shù)具有高度增殖與自我更新能力，具備多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。

早中期HCC根治術(shù)后高復(fù)發(fā)率導(dǎo)致患者的預(yù)后不良，因此加強(qiáng)HCC患者根治術(shù)后的監(jiān)測尤為重要。目前臨床上主要通過患者的臨床表現(xiàn)和病理檢查結(jié)果判斷HCC復(fù)發(fā)，但是HCC患者根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)是多因素、多基因相互作用所致?；蛐酒夹g(shù)具有快速、平行、高效、高通量的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中基因表達(dá)譜的變化，從而為腫瘤的診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。本研究利用基因芯片技術(shù)在所有已發(fā)現(xiàn)的microRNAs中檢測正常肝臟組織和早期復(fù)發(fā)、非早期復(fù)發(fā)肝癌組織中microRNAs差異表達(dá)譜，篩選與HCC根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)的microRNAs。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)早期復(fù)發(fā)組和正常組差異表達(dá)且有統(tǒng)計學(xué)意義的microRNAs有10個，相對于正常組、非早期復(fù)發(fā)組中miR-21-5p和miR-3651分別上調(diào)5.06倍和3.22倍。Cut-off值是通過使用陰性測定結(jié)果均值的2倍或3倍作為陽性判斷值。在對于樣本數(shù)相對足夠大的情況下，檢測指標(biāo)呈正態(tài)分布，在95.3%的陽性預(yù)測值的情況下通常取2倍作為陽性判斷值，若要求得到99%的陽性預(yù)測值，則選取3倍為陽性判斷值。因此通過檢測HCC患者肝臟組織中miR-21和miR-3651的表達(dá)量，可能用于推斷患者根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)潛能。對于肝臟組織中miR-21和miR-3651高表達(dá)患者可以給予相應(yīng)的輔助治療以預(yù)防HCC患者根治性手術(shù)后早期復(fù)發(fā)。

miR-21已經(jīng)被證實(shí)與肝癌、胃癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤有關(guān)，并且上調(diào)的miR-21可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)腫瘤的侵襲力，同時患者術(shù)后復(fù)發(fā)率增加，無瘤生存時間縮短，惡性程度高，預(yù)后差［6］。有研究多次證實(shí)miR-21通過抑制磷酸酶及張力蛋白同源等位基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性細(xì)胞死亡4（programmed cell death 4，PDCD4）基因的表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，通過抑制PTEN、PDCD4和新型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑RECK（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性［7~9］。有學(xué)者［10］在對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-21有促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉組織樣表型轉(zhuǎn)化的能力，從而使其具備腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和成瘤能力增強(qiáng)。在本研究中miR-21在早期復(fù)發(fā)組明顯上調(diào)，可以間接認(rèn)為miR-21與肝癌干細(xì)胞之間有可能存在某種關(guān)聯(lián)，促使HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)。同時為本課題組下一步探討miR-21、肝癌干細(xì)胞和HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)之間的分子機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)［11］miR-3651在口腔鱗癌中高表達(dá)，且表達(dá)水平與患者淋巴轉(zhuǎn)移、病理分級和腫瘤分化程度有關(guān)，對患者的預(yù)后產(chǎn)生一定的影響。本研究中高表達(dá)的miR-3651的患者早期復(fù)發(fā)率高，因此探討其對HCC早期復(fù)發(fā)的分子學(xué)機(jī)制十分重要。

非早期復(fù)發(fā)組相對于正常組有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達(dá)基因有6個，其中非早期復(fù)發(fā)組相對正常組的miR-451a下調(diào)了4.69倍。該結(jié)果顯示，對于肝癌組織中miR-451低表達(dá)的HCC患者早期復(fù)發(fā)率低。

miR-451在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)下調(diào)，限制RAS相關(guān)蛋白14的表達(dá)而發(fā)揮抑癌基因的作用，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中通過調(diào)控AMPK途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致患者的預(yù)后不良［12，13］。通過對人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO、人子宮頸癌細(xì)胞Hela、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-451模擬物發(fā)現(xiàn)，miR-451通過下調(diào)L6R基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成［14］。胃癌患者術(shù)前血漿中miR-451的表達(dá)水平明顯高于正常人，術(shù)后血漿中miR-451的表達(dá)水平顯著下降，因此血漿中miR-451可以作為篩查和動態(tài)檢測胃癌患者的標(biāo)志物［15］。本研究中miR-451表達(dá)下調(diào)的患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)率低，和Bandres等［16］學(xué)者的研究一致，該研究指出胃癌患者組織中miR-451低表達(dá)，并且其表達(dá)水平和胃癌預(yù)后呈正相關(guān)。同時miR-451在維持大腸癌腫瘤干細(xì)胞表型中起著關(guān)鍵作用，可以降低腫瘤干細(xì)胞致瘤性和對化療藥物的抵抗，減少自我更新［17］。本研究需要后續(xù)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-451、腫瘤干細(xì)胞和HCC患者早期復(fù)發(fā)的關(guān)系。

本研究不足之處在于所納入病例數(shù)較少，缺乏后續(xù)實(shí)驗(yàn)明確差異表達(dá)的microRNAs在臨床中的意義。同時缺乏原發(fā)瘤與復(fù)發(fā)瘤之間microRNAs差異表達(dá)的microRNAs的比較，因此無法確定復(fù)發(fā)灶是單中心復(fù)發(fā)還是多中心復(fù)發(fā)，有關(guān)方面有待深入研究。

總之，本研究提示miR-21和miR-3651的高表達(dá)與HCC根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)，為臨床探討HCC患者根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)提供可能的分子學(xué)依據(jù)。同時，臨床上對于肝組織miR-21和miR-3651高表達(dá)的患者應(yīng)該高度警惕，須采取有效的輔助治療措施以預(yù)防HCC患者根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)；miR-451低表達(dá)者早期復(fù)發(fā)率雖低，但對于miR-451低表達(dá)者的監(jiān)測也不能忽視。

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［2014-07-05收稿］［2014-08-28修回］［編輯 阮萃才］

Microarray-based screening to identify differentially expressed microRNAs associated with early recurrence of hepatocellular carcinoma after curative resection

JIANG Jing-hang1，GUO Zhe1，YANG Hao-jie1，YANG Fu-quan1，BAO Si-yang1，LI Le-qun1，YANG Ri-rong2，XIANG Bang-de1
（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Department of Immunology，School of Preclinical Medicine，Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）Corresponding author：XIANG Bang-de.E-mail：xiangbangde@163.com

Objective To screen for differentially expressed microRNAs associated with early recurrence of hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods Tissue samples were taken from 10 HCC patients who had undergone curative resection，comprising 5 patients who experienced early recurrence and 5 who did not.In addition，normal tissue from 4 individuals without HCC served as control samples.All samples were analyzed using microarrays to identify microRNAs specifically expressed in early-recurrence HCC.Results Several microRNAs were significantly upregulated in early-recurrence HCC relative to normal tissue：miR-21-3p，miR-21-5p，miR-222-3p，miR-3182，miR-3651，miR-3654，miR-4451，miR-4633-5p，and miR-720.Conversely，miR-4525 was significantly downregulated in early-recurrence HCC relative to normal tissue.Relative to normal tissue，several microRNAs were significantly upregulated in nonearly-recurrence HCC（miR-106b-5p，miR-3651，miR-4451，miR-93-5p）or downregulated（miR-3692-5p，miR-451a）.Conclusion MicroRNAs may play a key role in early recurrence of HCC after curative resection.

Liver neoplasm；MicroRNAs；Genechip；Recurrence

R735.7

A

1674-5671（2014）03-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.02

國家科技重大專項(xiàng)課題（2012ZX10002010001009）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260331；81360312）；2014年廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項(xiàng)目（YCSZ2014108）

向邦德。E-mail：xiangbangde@163.com