林格西,吳圣遷,江俊妮,王夢(mèng)嬋,陳 功,藍(lán)星宇,李向榮

(浙江大學(xué)城市學(xué)院 醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，浙江 杭州 310015)

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羽衣甘藍(lán)中多酚的提取與抗氧化活性研究

林格西,吳圣遷,江俊妮,王夢(mèng)嬋,陳 功,藍(lán)星宇,李向榮*

(浙江大學(xué)城市學(xué)院 醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，浙江 杭州 310015)

目的：優(yōu)化羽衣甘藍(lán)中多酚成分的提取工藝，確定羽衣甘藍(lán)最佳提取條件,研究多酚對(duì)三種自由基的清除率，進(jìn)一步分析羽衣甘藍(lán)中多酚的抗氧化活性。方法：多酚提取主要采用超聲波提取方法，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定優(yōu)化提取條件，采用鄰苯三酚自氧化法、Fenton反應(yīng)、DPPH法檢測(cè)其清除自由基。結(jié)果：羽衣甘藍(lán)優(yōu)化提取條件為：料液比1∶20,乙醇濃度為50%，提取時(shí)間40min，溫度40℃。根據(jù)該條件提取總多酚，提取率為6.4mg·g-1，清除自由基能力良好。對(duì)多酚總抗氧化活性能力進(jìn)行研究，其抗氧化特性較好。結(jié)論：采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化羽衣甘藍(lán)最佳提取條件，提取出的多酚成分對(duì)人體自由基清除作用良好，并具有較好的抗氧化活性。

羽衣甘藍(lán)；多酚；提取；抗氧化活性

植物多酚具有多種保健功能，其中最重要的是抗氧化功能。藥材羽衣甘藍(lán)中多酚成分對(duì)活性氧自由基具有較強(qiáng)的捕捉能力，且可對(duì)由氧自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用，具有明顯的抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等功能。因此，植物多酚在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等行業(yè)具有巨大的應(yīng)用前景和價(jià)值，而羽衣甘藍(lán)的抗氧化活性研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。由羽衣甘藍(lán)提取多酚并進(jìn)行抗氧化活性研究，對(duì)天然蔬菜食品和綜合利用農(nóng)資具有良好的經(jīng)濟(jì)效益[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 羽衣甘藍(lán)；無(wú)水乙醇：分析純，太倉(cāng)新太酒精有限公司；無(wú)水碳酸鈉(太倉(cāng)美達(dá)試劑有限公司)，分析純；福林酚試劑(上海澤衡生物技術(shù)有限公司)；沒(méi)食子酸對(duì)照品；DPPH(純度98.0%，美國(guó)SIGMA公司)；無(wú)水乙醇(中國(guó)杭州化學(xué)試劑有限公司)，純度99.7%；維生素C(中國(guó)杭州化學(xué)試劑有限公司)，純度99.7%；其它試劑為分析純。

1.1.2 儀器 超聲儀(KQ-700DB型控?cái)?shù)超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)7200型(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，JY6001型；純水儀(MILIPORE凈水系統(tǒng))；分析天平：梅特勒-托利分析天平(METTLER TOLEDOXS105,d=0.01mg)；真空泵：循環(huán)水式多用真空泵SHB-IIIA(河南省太康科教器材廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A型(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；恒溫水浴鍋HH4(國(guó)華電器有限公司)；PH計(jì)：PHS-C3型(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 多酚的提取 稱取一定量羽衣甘藍(lán)，洗凈，切成碎片，置于50℃烘箱中烘干，烘干后研磨成粉末狀，并封裝于真空干燥器內(nèi)備用；稱取0.8g羽衣甘藍(lán)粉末，在正交設(shè)定條件下采用超聲方法提取，提取液用真空抽濾泵抽濾，低溫保存[2]。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 提取條件：乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、溫度四個(gè)因素，每因素設(shè)定三個(gè)水平，進(jìn)行三水平四因素的正交實(shí)驗(yàn)，按L9(34)正交表的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，提取2次，合并提取液，測(cè)定提取液中多酚含量[3]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平因素

1.2.3 多酚含量測(cè)定 ①?zèng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5mL容量瓶中，加入1mL福林酚試劑，充分震蕩后靜置2～3min；各容量瓶均加入濃度為20% 的Na2CO3溶液2mL,搖勻，加入蒸餾水定容至刻度，置于25℃恒溫水浴鍋反應(yīng)1h；于波長(zhǎng)765nm處測(cè)定吸光度值，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用二元線性回歸法回歸線性方程。

②總酚含量測(cè)定。精密量取1mL羽衣甘藍(lán)提取液，分別加入1mL福林酚試劑和2mL Na2CO3溶液，搖勻，加入蒸餾水定容至刻度，置于25℃恒溫水浴鍋中水浴反應(yīng)1h；于波長(zhǎng)765nm處測(cè)定吸光度值，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。測(cè)得的吸光度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可測(cè)得羽衣甘藍(lán)中多酚成分的含量。

1.2.4 抗氧化活性的測(cè)定 ①對(duì)DPPH自由基的清除。稱取2,2-二苯代苦味?；?2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品20mg，無(wú)水乙醇定容至500mL，即得質(zhì)量濃度0.04mg·ml-1溶液。取溶液2mL，加入不同濃度樣品液2mL，室溫反應(yīng)30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，空白組以2mL無(wú)水乙醇代替樣品液，測(cè)試3組，采用Vc做對(duì)照, 計(jì)算清除率，公式為[4]：

DPPH 自由基清除率(E) =(1-A樣/A空)×100%

②對(duì)羥自由基的清除。 設(shè)置三種試管，未損傷管中加入2mL磷酸緩沖液(pH為7.4)和1mL鄰二氮菲(濃度為0.75mmol·L-1),混勻后加入0.75mmol·ml-1硫酸亞鐵溶液1mL，再加入蒸餾水1.5mL。損傷管以1mL濃度為0.01%的過(guò)氧化氫溶液代替，樣品管則加入0.5mL溶液，不同濃度樣品液以蒸餾水代替。所有試管均于37℃水浴反應(yīng)1h，于波長(zhǎng)537nm處分別測(cè)得吸光度。測(cè)試3組，采用Vc做對(duì)照，計(jì)算清除率，公式為[5]：

清除率= (A樣-A損/A未損-A損)×100%

③對(duì)超氧陰離子自由基的清除。 精密量取4.5mL濃度為50mmol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液( pH為8.2 )于試管中，加入1mL不同濃度樣品液，于25℃水浴反應(yīng)20min，加入25℃水浴預(yù)熱的3mmol·L-1鄰苯三酚0.3mL，在325nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，且每隔30s測(cè)定1次，聯(lián)系測(cè)定4min，以蒸餾水做空白對(duì)照。測(cè)試3組，并用Vc作對(duì)照，計(jì)算羽衣甘藍(lán)清除率，公式為[6]：

清除率= (△Ao-△A1/△Ao) ×100%

式中：Ao—空白組吸光度；A1—樣品吸光度。

④總抗氧化能力測(cè)定。 在2.5mL磷酸鹽緩沖液(pH為6.6)中加入不同濃度的樣品溶液2.5mL及1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL；混合物在50℃恒溫20min，加入濃度為10%的三氯乙酸溶液2.5mL，取5mL溶液加蒸餾水5mL和0.1%的FeCl3溶液1mL，于700nm處測(cè)定吸光度。采用蒸餾水作為無(wú)還原能力對(duì)照(調(diào)儀器零點(diǎn))，測(cè)試3組，以Vc作為對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03mg·mL-1，吸光度分別為0.362、0.43、0.534、0.601、0.686、0.771。根據(jù)測(cè)得結(jié)果，可繪制沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=164.57X+0.276，R2=0.997 7。見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以提取溶劑乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù))、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，進(jìn)行三水平四因素正交實(shí)驗(yàn)，以確定最佳提取條件。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羽衣甘藍(lán)多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，乙醇濃度、溫度、提取時(shí)間、料液比均對(duì)羽衣甘藍(lán)多酚成分提取率造成影響，其優(yōu)化最佳提取條件為A3B2C2D2，即乙醇濃度為50%，提取時(shí)間40min，溫度40℃，料液比為1∶20，可在此優(yōu)化提取條件提取多酚。最優(yōu)提取工藝提取羽衣甘藍(lán)多酚質(zhì)量濃度為0.32mg·mL-1，提取率為6.4mg·g-1，其中料液比對(duì)多酚的提取影響顯著。

2.3 抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 羥自由基清除能力 羽衣甘藍(lán)對(duì)羥自由基的清除能力較抗壞血酸強(qiáng)，隨著多酚濃度的增加呈上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

圖2 多酚對(duì)羥自由基清除能力

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力 采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定羽衣甘藍(lán)中多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。鄰苯三酚在堿性條件下可發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生濃度穩(wěn)定的超氧陰離子自由基與中間物，中間物可與超氧陰離子自由基反應(yīng)，得到一種具有顏色反應(yīng)的中間產(chǎn)物，對(duì)紫外線具有一定的吸收能力，引起某波長(zhǎng)處吸光值的線性積累，從而反映抗氧化劑清除能力的大小。

羽衣甘藍(lán)中多酚對(duì)超氧陰離子自由基清除能力較抗壞血酸弱，隨多酚濃度的增加呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3.3 DPPH自由基清除能力 DPPH屬于有機(jī)溶劑中一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，氮原子有1個(gè)孤對(duì)電子，呈紫色，于517nm處吸收較強(qiáng)。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH單電子被配對(duì)會(huì)使顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)處吸光度變小，且顏色變淺程度與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)劑量關(guān)系，因此可用于檢測(cè)自由基的清除能力，從而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品的抗氧化活性。

多酚對(duì)DPPH自由基清除能力較Vc不明顯，且隨著多酚質(zhì)量濃度增加清除能力呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 多酚對(duì)DPPH自由基清除能力

2.3.4 總抗氧化能力的測(cè)定 羽衣甘藍(lán)的總抗氧化能力較Vc不明顯，抗氧化能力較弱，且隨著多酚質(zhì)量濃度升高能力增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 多酚總抗氧化能力

3 討論

植物多酚來(lái)源較為廣泛，且安全無(wú)毒，并有一定的營(yíng)養(yǎng)和保健功效，相關(guān)研究一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羽衣甘藍(lán)中多酚成分對(duì)DPPH 、超氧陰離子和羥自由基均具有較強(qiáng)的清除效果，且抗氧化能力較好，可為羽衣甘藍(lán)進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。羽衣甘藍(lán)優(yōu)化提取條件為：料液比1∶20,乙醇濃度為50%，提取時(shí)間40min，溫度40℃。根據(jù)該條件提取總多酚，提取率為6.4mg·g-1，清除自由基能力良好。對(duì)多酚總抗氧化活性能力進(jìn)行研究，其抗氧化特性較好。

綜上所述，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化羽衣甘藍(lán)最佳提取條件，提取的多酚成分對(duì)人體自由基清除作用良好，并具有良好的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)初步探討羽衣甘藍(lán)多酚的提取工藝與抗氧化活性，關(guān)于多酚的分離純化及生物活性有效具體成分尚待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-08-27

浙江大學(xué)城市學(xué)院大學(xué)生科研基金(9x2013562114)

林格西，女，浙江大學(xué)城市學(xué)院在讀生，研究方向?yàn)樗帉W(xué)。

李向榮，男，浙江大學(xué)城市學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物藥效物質(zhì)的分離純化及藥效學(xué)。E-mail:lixr@zucc.edu.cn

R284.2;TQ461

A

1673-2197(2014)24-0014-03