姚強(qiáng)，閔科，鄧建良，許春妮，金俊

（江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院腫瘤科，江蘇 宜興 214200）

唑來(lái)膦酸對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901體外抗增殖及對(duì)VEGF的影響

姚強(qiáng)，閔科，鄧建良，許春妮，金俊

（江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院腫瘤科，江蘇 宜興 214200）

目的研究唑來(lái)膦酸對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901的體外增殖抑制作用及對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響。方法采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)唑來(lái)膦酸對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901的生長(zhǎng)抑制作用；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和半定量RT-PCR法檢測(cè)藥物對(duì)VEGF表達(dá)水平的變化。結(jié)果0.2～3.2μg/L的唑來(lái)膦酸能顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，且具有時(shí)間及劑量依賴性，不同藥物濃度作用后，胃癌細(xì)胞株VEGF的蛋白及基因表達(dá)水平均明顯降低(P＜005)，具有濃度依賴性。結(jié)論唑來(lái)膦酸能抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的生長(zhǎng)增殖，其作用機(jī)制可能為下調(diào)VEGF表達(dá)。

唑來(lái)膦酸；胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

胃癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，目前主要以手術(shù)、化療及放療為主要治療手段。胃癌在早期就易發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移，如何提高患者的生存率及生活質(zhì)量成為治療關(guān)鍵。唑來(lái)膦酸(ZOL)是第三代雙膦酸鹽類藥物，多個(gè)臨床前研究顯示ZOL具有一定的抗腫瘤作用[2-4]。本研究以人胃癌細(xì)胞株SGC-7901為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討唑來(lái)膦酸的抑瘤機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細(xì)胞株SGC-7901由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，唑來(lái)膦酸(澤泰，瑞士諾華制藥產(chǎn)品)RPIl640購(gòu)自Hyclone公司，新生牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司，CCK-8試劑盒、VEGF酶免試劑盒購(gòu)自上海銳賽生物有限公司，引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。VEGF引物上游：5'-CCTGGTG-GACATCTTCCAGGAGTACC-3'，下游：5'-GGAGCT CATCTCTCCTATGTGCTGGC-3，擴(kuò)增片段360 bp；β-actin引物上游：5'-AGAAGATGACCCAGATCATGTT-3'，下游：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，擴(kuò)增片段290 bp。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在含10%滅活新生小牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)基(含0.1%的青、鏈霉素)中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)將細(xì)胞用0.25%胰酶消化后傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5×104/ml加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組，12 h細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入終濃度為0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L的ZOL培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定每孔吸光度(A值)，記錄結(jié)果；實(shí)驗(yàn)計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)VEGF水平常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，濃度分別為0μg/L、0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L的ZOL培養(yǎng)基作用于胃癌細(xì)胞24 h，取離心后的細(xì)胞上清用于檢測(cè)，預(yù)實(shí)驗(yàn)有選擇性的稀釋待測(cè)標(biāo)本，計(jì)算各標(biāo)本的VEGF值，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 半定量RT-PCR法檢測(cè)VEGF-mRNA表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，ZOL濃度為0μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L的細(xì)胞培養(yǎng)基作用胃癌細(xì)胞48 h，以Trizol一步法提取總RNA，吸取4μl RNA樣品，加水至1 ml，在紫外分光光度計(jì)上對(duì)RNA進(jìn)行定量分析，確定RNA純度。逆轉(zhuǎn)錄cDNA，擴(kuò)增VEGF、β-actin(內(nèi)參)。PCR反應(yīng)體系：25μl反應(yīng)體系，5× PCR Buffer 5μl，200μmol/L dNTPs 2.5μl，1.5 mmol/L Mg2+1.5μl，上下游引物濃度為0.2μmol/L，各0.5μl，Taq酶2 U(0.5μl)，雙蒸水12.5μl，cDNA 2μl。VEGF反應(yīng)條件：94℃5 min，94℃45 s，56℃30 s，72℃50 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；β-actin反應(yīng)條件：94℃5 min，94℃45 s，51℃30 s，72℃50 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取5μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠經(jīng)Bio-RAD凝膠成像分析儀及GENE Tolls軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，測(cè)定各條帶的灰度值，各組圖像灰度值的均數(shù)與內(nèi)參β-actin均數(shù)的比值即為VEGF-mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)資料采用SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZOL對(duì)胃癌細(xì)胞株的增殖抑制作用CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.4μg/L的唑來(lái)膦酸在24 h及48 h的細(xì)胞相對(duì)增值率為(35±1.2)%和(58±2.3)%，0.8μg/L的唑來(lái)膦酸在24 h及48 h的細(xì)胞相對(duì)增值率為(40± 2.5)%和(70±1.9)%。結(jié)果表明，不同濃度唑來(lái)膦酸對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901均有明顯的增殖抑制作用，且具有時(shí)間、劑量依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 ZOL對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用

2.2 細(xì)胞上清VEGF水平變化結(jié)果顯示ZOL作用于SCGC-7901細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，VEGF水平逐漸降低，唑來(lái)膦酸濃度為0.8μg/L時(shí)VEGF抑制率為42%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同唑來(lái)膦酸濃度下VEGF水平變化

2.3 半定量RT-PCR法檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)水平變化0μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L的ZOL作用于胃癌細(xì)胞48 h后，進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增出相應(yīng)PCR產(chǎn)物，各組圖像灰度值數(shù)據(jù)為(0.81±0.08)、(0.42±0.07)、(0.23±0.05)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 半定量RT-PCR檢測(cè)VEGF-mRNA表達(dá)水平

3 討論

唑來(lái)膦酸是20世紀(jì)中期開(kāi)發(fā)的一種骨吸收抑制劑藥物，臨床上主要用于治療骨代謝障礙疾病，預(yù)防和治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的一系列骨相關(guān)事件。近來(lái)大量的體內(nèi)外試驗(yàn)證明唑來(lái)膦酸能直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力[5]。有關(guān)肺癌、乳腺癌、前列腺癌及肝癌等前期臨床試驗(yàn)提示唑來(lái)膦酸與細(xì)胞毒藥物、內(nèi)分泌藥物及靶向藥物聯(lián)合具有一定程度的協(xié)同抗腫瘤作用，并且在抗腫瘤藥物之后序貫應(yīng)用效果更好[6-7]。兩個(gè)正在進(jìn)行中的大型臨床研究(SWOG)-S0307和NATAN旨在比較唑來(lái)膦酸與其他雙磷酸鹽類輔助治療乳腺癌的作用以及比較唑來(lái)膦酸聯(lián)合紫杉類化療與單純化療治療乳腺癌的療效差異。該兩項(xiàng)研究的結(jié)果將為唑來(lái)膦酸潛在抗腫瘤的作用提供新的依據(jù)[8-9]。

目前知道的最重要的血管調(diào)控因子是VEGF[10-11]。過(guò)去認(rèn)為VEGF主要通過(guò)作用于間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用，并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有促進(jìn)有絲分裂和存活的作用。但最新的研究表明腫瘤細(xì)胞表面也有VEGF信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，因此阻斷VEGF信號(hào)傳導(dǎo)通路可以從多個(gè)方面抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究提示唑來(lái)膦酸從蛋白及基因水平均可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的VEGF表達(dá)。

綜上所述，唑來(lái)膦酸作為第三代雙膦酸鹽類藥物，不但能抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖，同時(shí)還抑制了VEGF的表達(dá)，值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Proliferation inhibition function of zoledronic acid on human gastric cancer cell SGC-7901 and its influence on VEGF.

YAO Qiang,MIN Ke,DENG Jian-liang,XU Chun-ni,JIN Jun.Department of Medical Oncology,the Yixing Hospital Affiliated to Jiangsu University,Yixing 214200,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the proliferation inhibition function of zoledronic acid on human gastric cancer cell SGC-7901 and its influence on vascular endothelial growth factor(VEGF).MethodsCCK-8 cell viability assay was performed to investigate the effect of zoledronic acid on cell proliferation.The expression of VEGF was examined by ELISA and semi-quantitative RT-PCR.ResultsZoledronic acid inhibited the proliferation of SGC-7901 cells at a dose-and-time dependent manner(concentration range∶0.2～3.2μg/L).Meanwhile,ELISA and semi-quantitative RT-PCR results showed that the expression of VEGF was down-regulated at a dose-dependent fashion in SGC-7901 cells.ConclusionZoledronic acid might inhibit the proliferation of SGC-7901 cells through down-regulation of VEGF.

Zoledronic acid;Gastric cancer;VEGF

R735.2

A

1003—6350（2014）19—2819—03

2014-01-13)

許春妮。E-mail：staff911@yxph.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1111