李伊培，高麗華，張連成，邵勇，劉羽 ，潘蕓 ，高招剛，張嶸，胡顯文，陳惠鵬

1.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京100071；3.安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230601

1971年，F(xiàn)orkman提出了腫瘤生長、轉移依賴新 血管生成的概念[1]。在已知的促血管生成因子中，血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的腫瘤治療靶點，VEGF家族主要包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF等，VEGF受體（VEGFR）主要包括VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR/Flk-1）、VEGFR3（Flt-4）、Neuropilin-1（Nrp-1）、Neuropilin-2（Nrp-2）等[2]。

VEGF家族中，VEGF-A是最主要的血管生成促進因子，結合并激活VEGFR1、VEGFR2。VEGFR1與VEGF-A結合的主要部位是胞外區(qū)的第2個類免疫球蛋白結構域（the second Ig-like domain of VEGFR1，VEGFR1D2）[3]。VEGFR1與VEGF-A有極高的親和力（Kd=1～10 pmol/L），是VEGF的誘捕性受體，但其酪氨酸激酶活性只有VEGFR2的約1/10[2]。VEGFR2主要通過胞外區(qū)的第2、第3個類免疫球蛋白結構域（the second and third Ig-like domains of VEGFR2，VEGFR2D2D3）與VEGF-A結合[3]，主要的血管生成信號均為VEGFR2被激活后產(chǎn)生的。因此，盡管其與VEGF-A的親和力遠不如VEGFR1，但VEGF-A激活靜止的內(nèi)皮細胞，促進細胞增殖、遷移和增加血管通透性等作用主要通過激活VEGFR2完成[2]。

此外，VEGFR1還與VEGF-B結合，VEGFR2還與VEGF-C、VEGF-D結合。VEGF-C與VEGF-D則主要與VEGFR-3結合，介導腫瘤的淋巴管生成和淋巴轉移[2]。

在本研究中，我們將VEGFR1D2和VEGFR2D3基因進行了優(yōu)化，并加入Linker區(qū)基因片段，與人IgG1 Fc片段相連，構建融合蛋白真核表達載體pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2，穩(wěn)定轉染CHO-K1細胞，通過加壓篩選陽性克隆獲得穩(wěn)定高表達目的蛋白的細胞株，并從細胞上清中純化獲得目的蛋白VEGF-Trap2進行后續(xù)性質鑒定。本研究旨在獲得更加優(yōu)化的VEGF-Trap，使其與VEGF有較高的親和力，有效阻斷VEGF途徑介導的腫瘤血管生成，抑制血管內(nèi)皮細胞及相關腫瘤細胞的增值、遷移、黏附，同時使腫瘤血管內(nèi)皮細胞和周細胞凋亡，為研發(fā)更有效的抗腫瘤血管生成藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態(tài)大腸桿菌Top10購自北京全式金公司；CHO-K1細胞、真核表達載體pIRES2-EGFP-Fc、陽性對照蛋白VEGF-Trap1由本室保存；優(yōu)化的目的基因VEGFR1D2/R2D3由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；PCR引物由Invitrogen公司合成；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、NheⅠ）、T4DNA連接酶購自New England Biolabs公司；瓊脂糖凝膠產(chǎn)物回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；200 bp DNA ladder購自上海近岸蛋白科技有限公司；細胞轉染試劑LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；無血清培養(yǎng)基DMEM/F-12（1∶1）購自Hyclone公司；小牛血清購自杭州四季青生物技術公司；OPTI-MEM培養(yǎng)基、G418購自Gibco公司；Mab Select Protein A親和填料購自GE公司；蛋白PageRuler購自Fermentas公司；可溶性hVEGF165重組表達蛋白購自上海近岸蛋白科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗人IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TMB顯色液購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；所有測序工作由Invitrogen公司完成。

1.2 真核表達載體pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2的構建

優(yōu)化的VEGFR1D2/R2D3基因兩端分別帶有BamHⅠ和NheⅠ酶切位點，連接于pUC57質粒。用BamHⅠ/NheⅠ同時對該質粒和含有人IgG1 Fc片段的空載體pIRES2-EGFP-Fc進行雙酶切，12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接上述酶切產(chǎn)物，命名為pIRES2-EGFPVEGF-Trap2；連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，經(jīng)菌落PCR、雙酶切驗證、基因測序結果比對正確后，用試劑盒抽提重組質粒。

1.3 細胞培養(yǎng)及脂質體介導的pIRES2-EGFPVEGF-Trap2轉染CHO-K1細胞

CHO-K1細胞用含5%小牛血清的DMEM/F-12（1∶1）完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。轉染前將CHO-K1細胞接種于24孔板，待生長至90%匯合時，按脂質體轉染試劑LipofectAMINE 2000操作說明，將重組質粒pIRES2-EGFP-VEGFTrap2轉染至CHO-K1細胞。

1.4 篩選高表達陽性克隆

轉染48 h后將細胞消化至細胞培養(yǎng)瓶，用750 mg/L G418加壓篩選，約15 d后，無G418抗性的細胞幾乎全部死亡，用有限稀釋法將細胞稀釋至96孔細胞培養(yǎng)板進行克隆培養(yǎng)，2周后更換無血清培養(yǎng)基，24 h后用直接ELISA法[4]檢測上清中目的蛋白的表達量，以篩選高表達目的蛋白的陽性克隆。

1.5 VEGF-Trap2的表達純化和鑒定

篩選出的高表達陽性克隆擴大培養(yǎng)至2000 mL轉瓶，收集無血清培養(yǎng)上清，用0.45 μm微孔濾膜除去細胞碎片等雜質，調節(jié)pH值至7.4，用A蛋白親和層析柱純化，上樣流速5 mL/min（純化條件：平衡緩沖液0.5 mol/L Tris-HCl+0.5 mol/L NaCl，pH7.4；洗脫液0.1 mol/L Gly-HCl，pH3.0）。280 nm波長處檢測紫外吸收峰，收集管中含有pH9.0的飽和精氨酸溶液以中和目的蛋白pH值至中性。按說明書操作用BCA法精確定量蛋白濃度，還原型SDS-PAGE鑒定目的蛋白。

1.6 非競爭ELISA測定VEGF-Trap2與hVEGF165的特異性結合

參照Beatty等[5-7]的方法，將hVEGF165用包被液梯度稀釋至2、1、0.5、0.25 ng/μL，每孔100 μL包被96孔微孔板（設內(nèi)對照孔），37℃孵育2 h；PBST（0.05%Tween-20）洗板3次，每次 5 min，5%BSA（PBS配制）封閉，37℃孵育2 h；封閉結束洗板后，分別將10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5ng/μL的VEGF-Trap2加至hVEGF165包被的孔中，每孔100 μL，每個濃度3個復孔，37℃孵育2 h；孵育結束洗板后，每孔加入100 μL用1%BSA（PBS配制）以1∶5000稀釋的HRP標記的山羊抗人IgG抗體，37℃孵育1 h后洗板，加入TMB顯色液避光10 min顯色，讀取D405nm值；以VEGF-Trap2的濃度為橫坐標、相應的D405nm值為縱坐標，繪制不同濃度hVEGF165包板條件下VEGF-Trap2與其結合的反應曲線。陽性對照組中，VEGF-Trap1是未優(yōu)化的VEGFR1D2/VEGFR2D3與人IgG Fc的融合蛋白，其構建表達及純化條件與VEGF-Trap2完全相同。

1.7 生物膜干涉（biolayer interferometray，BLI）測定VEGF-Trap2與hVEGF165的親和力

通過Octet分子相互作用技術平臺測定VEGFTrap2與hVEGF165的親和力及動力學參數(shù)，陽性對照為VEGF-Trap1，空白對照為PBS緩沖液。在Forte Bio QK分析儀上裝載抗人IgG Fc生物傳感器，設定程序，運行。

2 結果

2.1 真核表達載體pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2的構建及鑒定

目的基因VEGFR1D2/R2D3與pIRES2-EGFPFc載體經(jīng)BamHⅠ/NheⅠ雙酶切后連接，重組產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，挑取陽性克隆進行菌落PCR驗證，重組質粒pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2經(jīng)BamHⅠ/NheⅠ雙酶切后用12 g/L瓊脂糖電泳分析，條帶與預期結果相符（圖1）。將酶切驗證正確的質粒測序，結果正確，表明構建了真核表達載體pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2（圖 2），擴增并提取重組質粒。

圖1 重組質粒pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2的酶切鑒定M：200 bp DNA ladder；1：BamHⅠ/NheⅠ雙酶切重組質粒

2.2 pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2 轉染 CHO-K1 細胞及陽性克隆的獲得

重組質粒pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2轉染CHO-K1細胞6 h后，更換含5%小牛血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后在顯微鏡下觀察，實驗組在綠色激發(fā)光下大部分細胞可見綠色熒光信號（圖3），表明已將目的基因轉染至CHO-K1細胞并且有目的蛋白表達。對照組細胞未見綠色熒光。

在加壓篩選過程中，用750 mg/L G418篩選轉染重組質粒的陽性細胞克隆，有限稀釋法將多個克隆消化至96孔細胞培養(yǎng)板進行單克隆化。2周后，在熒光顯微鏡下清晰可見單克隆細胞完全呈綠色（圖4），即重組質粒穩(wěn)定轉染細胞，獲得穩(wěn)定表達融合蛋白的單克隆。

2.3 VEGF-Trap2的親和純化及SDS-PAGE鑒定

無血清培養(yǎng)上清經(jīng)過濾處理后，用A蛋白親和層析柱純化，洗脫時，280 nm波長處紫外檢測峰為單一峰（圖5）。親和純化獲得的VEGF-Trap2經(jīng)還原型SDS-PAGE鑒定，考馬斯亮藍G250染色，在相對分子質量72×103處有清晰的蛋白條帶（圖6），與預期結果相符，無其他蛋白條帶可見。

圖2 重組質粒pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2示意圖

圖3 熒光顯微鏡觀察VEGF-Trap2在CHO-K1細胞中的表達（100×）A：明視場照明；B：暗視場照明

圖4 熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定轉染重組質粒pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2的CHO-K1細胞形成的單克隆（40×）A：明視場照明；B：暗視場照明

2.4 VEGF-Trap2與hVEGF165的結合反應曲線及功能性親和常數(shù)

將曲線（圖7）右側的平臺期作為最大D405nm值，用作圖法得每條曲線半數(shù)D405nm值處所對應的蛋白質量濃度，換算成摩爾濃度，代入Beatty法公式（下式）求親和常數(shù)：

式中，n=Ag/Ag'，Ab和Ab'分別代表抗原濃度為Ag與Ag'時產(chǎn)生半數(shù)D405nm值的抗體摩爾濃度。

本實驗中，將hVEGF165作為抗原、VEGF-Trap作為抗體進行計算。n=2時得3個K值，n=4時得2個K值，n=8時得1個K值，取6個K值的均值作為最終結果。經(jīng)過對2種蛋白與hVEGF165結合曲線的測定，求得VEGF-Trap2的功能性親和常數(shù)為1.86×107L/mol；陽性對照組中，VEGF-Trap1的功能性親和常數(shù)為2.57×107L/mol。該結果表明獲得的基因重組蛋白VEGF-Trap2與hVEGF165有很強的親和力。

圖5 VEGF-Trap2純化過程的紫外吸收圖

圖6 純化后VEGF-Trap2的還原型SDS-PAGEM：標準蛋白；1：純化的VEGF-Trap2蛋白

2.5 VEGF-Trap2與hVEGF165的動力學結合參數(shù)

VEGF-Trap2、VEGF-Trap1與 hVEGF165的結合及解離過程見圖8。陽性對照VEGF-Trap1與hVEGF165的動力學結合參數(shù) Ka、Kd和 KD分別為 2.93×105L/（mol·s）、57.6×10-4s-1和19.7×10-9mol/L；VEGF-Trap2與 hVEGF165的動力學結合參數(shù)Ka、Kd和KD分別為2.31×105L/（mol·s）、7.23×10-4s-1和3.13×10-9mol/L。VEGF-trap2、VEGF-Trap1與hVEGF165均有很高的親和力。

3 討論

圖7 VEGF-Trap2及VEGF-Trap1與hVEGF165結合的反應曲線圖中4條曲線的hVEGF165包板濃度分別為2、1、0.5和0.25 ng/μL

圖8 VEGF-Trap2及VEGF-Trap1與hVEGF165的結合-解離曲線A：VEGF-Trap2；B：VEGF-Trap1

VEGF mRNA在人類許多腫瘤組織，如腎癌、乳腺癌、結直腸癌中表達[8]。VEGF的過表達是腫瘤轉移的重要特征。近年來，以VEGF及VEGFR為靶點的抗腫瘤血管生成藥物在治療惡性腫瘤方面取得了令人矚目的成績。2012年，由VEGFR1D2/R2D3與人IgG1 Fc片段融合而成的Zaltrap（即VEGF-Trap）獲準上市[9]。

VEGF-Trap與VEGF-A有極高的親和力，可誘捕游離的VEGF-A，有效阻斷腫瘤細胞VEGF旁分泌和自分泌信號傳導途徑。同時，VEGF-Trap與PIGF-2、VEGF-B也有較強的結合能力[10]，避免了因阻斷單一血管生成因子而帶來的其他血管生成因子高表達的腫瘤血管援救反應。VEGF的自分泌也存在于正常生理狀態(tài)下，長期阻斷內(nèi)皮細胞間的VEGF信號或直接封閉VEGFR2，會對正常組織的血管產(chǎn)生危害[11-12]。一些小分子抗腫瘤血管生成藥物如VEGFR2抑制劑能自由進出細胞，完全抑制VEGFR2的激活[12]，產(chǎn)生高血壓、血栓栓塞、蛋白尿等副作用。而VEGF-Trap作為大分子藥物，對VEGFR2的磷酸化作用影響較小，臨床實驗數(shù)據(jù)表明，VEGF-Trap的副作用更小，安全性更高[13]。

在本研究中，我們將VEGF-Trap基因序列進行修飾，用基因工程手段將基因VEGFR1D2與VEG?FR2D3連接到人IgG1 Fc片段上，構建真核表達載體pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2，為保證目的蛋白的生物學活性，我們將VEGF-Trap2基因轉染哺乳動物細胞CHO-K1，挑選出高表達陽性單克隆擴大培養(yǎng)，成功獲得重組蛋白VEGF-Trap2。

值得注意的是，雖然hVEGF165與VEGF-Trap2和VEGF-Trap1的結合常數(shù)（Ka）沒有明顯差異，但hVEGF165與VEGF-Trap2的平衡解離常數(shù)（KD）比其與VEGF-Trap1的KD值更低，只有后者的1/6左右，這表明VEGF-Trap2與hVEGF165的結合更為牢固。Beatty等建立的采用非競爭性ELISA法測定抗原-抗體功能性親和常數(shù)的方法盡管在理論上不十分完整，但因為其不受抗原分子大小的限制，操作簡便，而被廣泛應用。VEGF-Trap2與VEGF的高親和力是其阻斷VEGF信號通路的關鍵，所以本研究中我們模擬抗原-抗體的親和力測試方法，用Beatty等建立的方法驗證VEGF-Trap2與hVEGF165之間的親和力高低。通過非競爭性ELISA法及Forte Bio儀器檢測，均證明VEGF-Trap2與hVEGF165有較高的親和力，表明我們獲得的重組蛋白有生物學活性，能誘捕VEGF-A，阻斷VEGF信號傳導途徑，為下一步的體外細胞實驗及體內(nèi)實驗奠定了基礎。

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