李琳，郭彥，趙光宇，于虹，孫世惠，潘婷，唐健，周育森，樊衛(wèi)平

1.山西醫(yī)科大學(xué) 微生物與免疫學(xué)教研室，山西 太原 030001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respira?tory syndrome coronavirus，MERS-CoV）是一種新型冠狀病毒[1]，它可以使感染者出現(xiàn)急性、嚴(yán)重呼吸道疾病，伴有發(fā)熱、咳嗽、氣短及呼吸困難，部分病例出現(xiàn)腎功能衰竭和死亡[2-3]，是一種高致病性病毒?；畈《局泻驮囼?yàn)一直是檢測(cè)血清抗體中和活性、評(píng)價(jià)抗體抗病毒作用的重要方法。但高致病性病毒的活病毒中和試驗(yàn)需要高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和人員素質(zhì)提出了更高的要求，增加了實(shí)驗(yàn)實(shí)施的難度和成本。為了克服MERS-CoV活病毒感染和中和試驗(yàn)在安全、效率等方面存在的諸多困難和不便，我們建立了一種MERS假病毒系統(tǒng)，并應(yīng)用于抗體中和活性檢測(cè)的中和試驗(yàn)。為MERS-CoV疫苗與抗體評(píng)價(jià)及病毒致病機(jī)制研究提供一種安全、有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞和COS-7細(xì)胞均由本室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒均購(gòu)自北京全式金公司；MERS-CoV S基因（GenBank：JX869059.2）由生工生物工程（上海）有限公司合成，合成基因的上游帶有BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游順序含有終止密碼子和XhoⅠ酶切位點(diǎn)；缺少Env基因而表達(dá)螢光素酶的人類免疫缺陷病毒（HIV）骨架質(zhì)粒pNL4-3.Luc.RE、表達(dá)水泡性口炎病毒（VSV）G蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pVSV-G 和載體質(zhì)粒 pcDNA3.1 由本室保存[4]；DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒去內(nèi)毒素大量提取試劑盒購(gòu)自天根公司；轉(zhuǎn)染試劑TurboFect、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購(gòu)自Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)器材購(gòu)自CORNING公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、OMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和青霉素鏈霉素抗生素均購(gòu)自GIBCO公司；兔抗HIV-1 P24多抗和兔抗MERS-CoV S1多抗購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物技術(shù)公司；螢光素酶底物購(gòu)自Promega公司；對(duì)MERS-CoV具有中和活性的MERS-CoV受體結(jié)合區(qū)特異性小鼠血清、H5N1禽流感病毒HA抗原特異性小鼠血清和正常小鼠血清均經(jīng)過(guò)受體破壞酶（RDE）處理和56℃、30 min補(bǔ)體滅活，由本室制備和保存[5-6]。

1.2 pMERS-S的質(zhì)粒構(gòu)建及擴(kuò)增

載體質(zhì)粒pcDNA3.1經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后與經(jīng)相同酶切后回收的MERS-CoV S基因片段連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pMERS-S，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐西林抗性篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒提取質(zhì)粒備用。

1.3 假病毒的制備

將 pMERS-S 和 pNL4-3.Luc.RE 兩種質(zhì)粒各 20 μg逐滴加入4 mL OMEM培養(yǎng)基中，輕輕振蕩后再逐滴加入80 μL TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，輕輕彈動(dòng)管壁后室溫靜置15 min，將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的混合物逐滴加入293T細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)液棄去，換成新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后收獲含MERS假病毒（pMERS-S）的上清，6000 r/min離心15 min去除細(xì)胞碎片后將上清分裝，-80℃保存。用同樣方法，分別利用pVSV-G和pcDNA3.1質(zhì)粒制備作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的VSV假病毒（pVSV-G）和pcDNA3.1假病毒（pEnv-）。

1.4 Western印跡

將制備的含假病毒的培養(yǎng)上清用PEG6000濃縮至1/50后加入上樣緩沖液，100℃處理10 min，進(jìn)行SDS-PAGE（分別采用8%和12%SDS-PAGE檢測(cè)假病毒中MERS-CoV S抗原和HIV-1 P24抗原的表達(dá)），電泳后按常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜（200 mA，150 min），轉(zhuǎn)膜完成后，用脫脂牛奶（5 g/mL）常溫封閉4 h，進(jìn)行Western印跡，一抗為1 μg/mL兔抗MERS-CoV S1抗原或兔抗HIV-1 P24多抗，二抗為1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，ECL化學(xué)發(fā)光法觀察結(jié)果。

1.5 MERS假病毒的感染力測(cè)定

將4×105/mL的Huh-7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)16 h，使細(xì)胞長(zhǎng)成單層；加入梯度稀釋的MERS假病毒，100 μL/孔，每個(gè)稀釋度設(shè)置復(fù)孔；設(shè)置未加假病毒的空細(xì)胞對(duì)照，分別以VSV假病毒和pcDNA3.1假病毒作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照；37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)螢光素酶活性（相對(duì)光單位，RLU），以此反映MERS假病毒的感染力。

1.6 MERS假病毒中和試驗(yàn)

將4×105/mL Huh-7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)16 h，使細(xì)胞長(zhǎng)成單層；將血清從1∶40開(kāi)始梯度稀釋后與等體積的MERS假病毒（RLU=40000）混合，設(shè)置復(fù)孔，于37℃、5%CO2放置1 h；之后將血清-假病毒混合液接種于單層Huh-7細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未與血清混合的假病毒對(duì)照和只加培養(yǎng)基的空細(xì)胞對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；檢測(cè)螢光素酶活性（RLU），按照下式計(jì)算血清抗體中和百分率（%）：

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism軟件，對(duì)MERS假病毒感染細(xì)胞的RLU值與假病毒量的相關(guān)性進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MERS假病毒（pMERS-S）的制備與鑒定

用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MERS-S，獲得了與載體（5372 bp）和MERS-CoV S基因（4068 bp）大小相符的2條DNA條帶（圖1）。DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MERS-S中正確插入了MERS-CoV S基因。將pcDNA3.1-MERS-S與假病毒包裝骨架質(zhì)粒pNL4-3.Luc.RE共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備攜帶MERS-CoV S蛋白的假病毒（pMERS-S）。同時(shí)，分別以pVSV-G和pEnv-作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明，用HIV-1 P24抗體檢測(cè)時(shí)，pMERS-S、pVSV-G 和pEnv-三種假病毒在相對(duì)分子質(zhì)量25×103處均有條帶，與預(yù)期大小相符（圖2），表明利用HIV骨架質(zhì)粒（pNL4-3.Luc.RE）成功包裝出假病毒。當(dāng)用MERSCoV S1特異性抗體檢測(cè)時(shí)，只有pMERS-S在相對(duì)分子質(zhì)量約180×103位置出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶（圖2），表明假病毒pMERS-S表達(dá)MERS-CoV S蛋白。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MERS-S的酶切鑒定1：重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MERS-S經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切；M：Trans 15k DNA marker

2.2 MERS假病毒（pMERS-S）的感染力測(cè)定

為了明確包裝出的MERS假病毒能否感染含有MERS-CoV受體（二肽基肽酶4，DPP4）的細(xì)胞，用pMERS-S分別感染表達(dá)DPP4的Huh-7細(xì)胞和不表達(dá)DPP4的COS-7細(xì)胞。結(jié)果表明，pMERS-S對(duì)Huh-7細(xì)胞具有感染力，且假病毒的量與感染力呈量效關(guān)系（P＜0.01，Pearson相關(guān)分析），隨著pMERSS稀釋度的增加，假病毒感染Huh-7細(xì)胞的RLU值逐漸下降。pMERS-S感染的COS-7細(xì)胞只檢測(cè)出本底水平的熒光值。VSV對(duì)于Huh-7和COS-7細(xì)胞都具有感染力，而pVSV-G感染的這兩種細(xì)胞均可檢測(cè)出高水平熒光值。pEnv-因缺少跨膜蛋白而不感染Huh-7和COS-7細(xì)胞，只檢測(cè)到本底水平的熒光值。見(jiàn)圖3。

2.3 MERS假病毒中和試驗(yàn)

為了驗(yàn)證制備的MERS假病毒能否通過(guò)中和試驗(yàn)進(jìn)行抗體中和活性的檢測(cè)，利用已知對(duì)MERSCoV具有中和活性的小鼠血清進(jìn)行假病毒中和試驗(yàn)，同時(shí)以正常小鼠血清和重組H5N1 HA抗原免疫小鼠血清為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，對(duì)MERS-CoV具有中和活性的血清通過(guò)MERS假病毒中和試驗(yàn)同樣檢測(cè)出中和活性，并且隨著血清稀釋度的增加，其對(duì)MERS假病毒的中和作用逐漸下降，而2種陰性對(duì)照血清對(duì)MERS假病毒并無(wú)中和作用（圖4）。表明制備的pMERS-S可用于假病毒中和試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)血清抗體的中和活性。

圖2 假病毒的Western印跡1：pEnv-；2：pMERS-S；3：pVSV-G；M：蛋白marker

圖3 假病毒對(duì)不同細(xì)胞系的感染力

圖4 假病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

MERS-CoV是繼SARS-CoV之后出現(xiàn)的又一種對(duì)人類具有高致病性的冠狀病毒[7]。截至2013年7月，已累計(jì)感染70人，病死率為55.7%[8]。由于該病毒對(duì)人類的致病性強(qiáng)、病死率高，并且已出現(xiàn)了有限的人際傳播感染[9]，因此，預(yù)防與治療手段的研究對(duì)于防控MERS疫情具有重要意義，而用于預(yù)防與治療效果評(píng)價(jià)的技術(shù)和手段具有重要的支撐作用。中和試驗(yàn)一直是評(píng)價(jià)抗體抗病毒作用的重要方法，但利用MERS-CoV的活病毒開(kāi)展中和試驗(yàn)需要生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3），并且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的生物安全操作素質(zhì)要求很高。這無(wú)疑增加了試驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)和成本。MERS假病毒顆粒由于只具有一次感染能力而無(wú)復(fù)制能力，應(yīng)用于血清中和抗體的檢測(cè)并不需要BSL-3的實(shí)驗(yàn)條件，極大地降低了實(shí)驗(yàn)操作的風(fēng)險(xiǎn)，提高了效率。

假病毒體系的構(gòu)建主要包括以反轉(zhuǎn)錄病毒載體和以慢病毒載體為基礎(chǔ)的2種方式，目前最常用的是以慢病毒載體為基礎(chǔ)的假病毒構(gòu)建體系。我們利用 HIV-1 骨架質(zhì)粒 pNL4-3.Luc.RE，通過(guò)與攜帶MERS-CoV S基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得只具有一次感染能力而無(wú)復(fù)制能力的MERS-CoV假病毒顆粒。由于pNL4-3.Luc.RE骨架質(zhì)粒中HIV-1基因缺乏Env基因，假病毒的包膜蛋白需要由另一質(zhì)粒上的MERS-CoV S基因表達(dá)來(lái)提供，因此，MERS假病毒顆粒的感染性受其S蛋白識(shí)別受體的限制。本研究制備的MERS假病毒能很好地感染含MERS-CoV受體的Huh-7細(xì)胞，但對(duì)于無(wú)DPP4表達(dá)的COS-7細(xì)胞就不具有感染性，而目前已知MERS-CoV正是利用DPP4作為它進(jìn)入宿主細(xì)胞的受體[10]。在假病毒中和試驗(yàn)中，MERS假病毒能被中和抗體有效中和而失去對(duì)宿主細(xì)胞的感染作用。本研究使用的中和抗體不僅具有活病毒中和試驗(yàn)證實(shí)的中和活性，而且已知對(duì)MERS-CoV S蛋白受體結(jié)合區(qū)具有特異性。這進(jìn)一步說(shuō)明，MERS假病毒顆粒所攜帶的S包膜蛋白與MERS-CoV S蛋白一樣具有介導(dǎo)病毒感染的作用。而這種病毒受體識(shí)別特性，使MERS假病毒不僅可用于疫苗誘導(dǎo)中和抗體能力和抗體抗病毒效果的評(píng)價(jià)，也可用于病毒受體相關(guān)致病機(jī)制的研究。因此，本研究建立的MERS假病毒系統(tǒng)是一種對(duì)MERS-CoV疫苗、藥物及致病機(jī)制研究具有良好支撐作用的技術(shù)手段。

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