郭晶晶，于虹，楊裔，孫維來(lái)，肖文珺 ，郭彥 ，寇志華，周育森

1.中南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

活化相關(guān)分泌蛋白1（activation-associated se?creted protein-1，ASP-1）是盤(pán)尾絲蟲(chóng)L3期分泌的一種重要蛋白[1]，在宿主體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能，可降低宿主的免疫應(yīng)答[2-3]，起到免疫逃逸作用[4]，其相對(duì)分子質(zhì)量為 24.9×103[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ASP-1 無(wú)需佐劑就能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的IgG抗體，包括IgG1、IgG2a類(lèi)抗體，誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有Th1型優(yōu)勢(shì)[6]。ASP-1作為非毒素類(lèi)生物佐劑，還可以增強(qiáng)多種形式的抗原，如蛋白抗原、多肽抗原或疫苗的免疫原性，能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫[7-8]。ASP-1發(fā)揮佐劑活性的機(jī)制研究表明，ASP-1通過(guò)與抗原提呈細(xì)胞上的TLR2、TLR4結(jié)合，激活A(yù)PC，進(jìn)而誘導(dǎo)Th1型和Th2型細(xì)胞因子，包括IFN-γ、TNF-α，IL-5等分泌，發(fā)揮佐劑活性[9]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)ASP-1的免疫原性較強(qiáng)，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身抗體的情況下，其佐劑活性有所下降[10]。因此，降低ASP-1的免疫原性的同時(shí)保留其佐劑活性有重要意義，但目前ASP-1的佐劑活性功能區(qū)及作用機(jī)制尚不清楚。因此，研究ASP-1佐劑的活性功能區(qū)及作用機(jī)制，對(duì)于深入認(rèn)識(shí)并應(yīng)用這種新型佐劑具有重要意義。

單克隆抗體是系統(tǒng)研究ASP-1的佐劑活性功能區(qū)及發(fā)揮佐劑活性作用機(jī)制的重要工具，但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)ASP-1單克隆抗體，因此，制備ASP-1特異性單克隆抗體并明確其抗原結(jié)合域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。我們制備了5株能穩(wěn)定分泌抗ASP-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并用制備的單抗對(duì)ASP-1保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了鑒定，為深入研究ASP-1佐劑活性功能域奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡BALB/c雌性小鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0由本實(shí)驗(yàn)室保存；甘油中保存的重組菌pQE30/M15/ASP-1、無(wú)關(guān)抗HA單抗及無(wú)關(guān)蛋白TF由本室提供；IPTG購(gòu)自金科宏達(dá)公司；Ni-charged resin及內(nèi)毒素鱟試劑檢測(cè)試劑盒購(gòu)自金斯瑞公司；PEG-6000購(gòu)自Roche公司；蛋白marker、蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根公司；鼠抗His抗體、HRP-山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；ELISA顯色液A、B及終止液購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物制藥公司；超敏發(fā)光液、PVDF膜購(gòu)自MILLIPORE公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基、1%HT培養(yǎng)液購(gòu)自北京天潤(rùn)善達(dá)科技有限公司；透析袋MD34購(gòu)自北京瑞達(dá)恒輝公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（ELx808）購(gòu)自BioTek公司。

1.2 ASP-1重組蛋白的表達(dá)純化及鑒定

重組ASP-1的表達(dá)純化參照文獻(xiàn)進(jìn)行[11]。利用梯度復(fù)性法，即6 mol/L尿素-2 mol/L尿素-PBS對(duì)目的蛋白進(jìn)行復(fù)性，用Balford法測(cè)定蛋白濃度，對(duì)重組ASP-1進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，即在分裝有100 μL鱟試劑溶液的試管中加入100 μL樣品，設(shè)立陰性對(duì)照（無(wú)內(nèi)毒素水）、陽(yáng)性對(duì)照（內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品），37℃恒溫器孵育60 min取出觀察結(jié)果，依據(jù)是否出現(xiàn)凝膠判斷是否為陽(yáng)性。

1.3 抗ASP-1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備、篩選及細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)測(cè)定

取6只6～8周齡BALB/c雌性小鼠，不加佐劑免疫重組ASP-1（每只25 μg/次），每3周免疫1次，共免疫3次，用間接ELISA檢測(cè)至血清中抗ASP-1抗體效價(jià)達(dá)到106以上。

融合前1周復(fù)蘇小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞，用含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞制得小鼠骨髓瘤細(xì)胞懸液，同時(shí)處死免疫小鼠，無(wú)菌取脾制得脾細(xì)胞懸液，待融合。

細(xì)胞融合采用常規(guī)方法進(jìn)行[12]。融合前1 d取正常小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，取骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞和免疫小鼠脾細(xì)胞，以PEG1500為融合劑進(jìn)行融合，采用間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞。將初步篩選得到的陽(yáng)性細(xì)胞克隆株用有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆，篩選出穩(wěn)定高表達(dá)單克隆抗體的特異性雜交瘤細(xì)胞株。用ASP-1包被，采用間接ELISA測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)液上清中的抗體效價(jià)。

1.4 含單克隆抗體腹水的制備及效價(jià)測(cè)定

選擇擴(kuò)大培養(yǎng)后狀態(tài)良好的亞克隆篩選出的高表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞株凍存；復(fù)蘇凍存的雜交瘤細(xì)胞，10～15 d后收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用PBS洗滌3次，配成濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液，腹腔注射事先用液體石蠟致敏的BALB/c雌性小鼠，每只0.5 mL；10～12 d后小鼠腹部明顯膨大，采集腹水并離心，收集上清，置-70℃保存；用ASP-1蛋白包被，采用間接ELISA測(cè)定腹水效價(jià)。

1.5 單克隆抗體特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體的特異性鑒定 用ASP-1蛋白包被抗原，以稀釋的腹水單抗為一抗、無(wú)關(guān)腹水抗HA單抗為陰性對(duì)照、HRP-羊抗小鼠IgG為二抗，測(cè)量D450nm值，＞2倍對(duì)照組D450nm平均值即判斷為陽(yáng)性。

1.5.2 單克隆抗體的亞類(lèi)鑒定 采用間接ELISA，以ASP-1重組蛋白為抗原，包被濃度為2 μg/mL，以收集的雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，使用不同IgG亞類(lèi)鑒定試劑盒里的酶標(biāo)二抗（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA）進(jìn)行鑒定。酶標(biāo)儀檢測(cè)D450nm值，＞2倍對(duì)照組D450nm平均值即判斷為陽(yáng)性。

1.6 單克隆抗體識(shí)別ASP-1保守結(jié)構(gòu)域的鑒定

1.6.1 單抗識(shí)別8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域單肽的ELISA檢測(cè) 運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)ASP-1全長(zhǎng)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，設(shè)計(jì)并合成了8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的單肽。采用間接ELISA，以合成的ASP-1的8個(gè)單肽為包被抗原，包被濃度為5 μg/mL，以5株腹水為一抗，多克隆陽(yáng)性血清及陰性血清分別為陽(yáng)性、陰性對(duì)照，HRP-山羊抗小鼠IgG為二抗，檢測(cè)D450nm值，＞2倍對(duì)照組D450nm平均值即判斷為陽(yáng)性。

1.6.2 單抗識(shí)別ASP-1及截短片段PRM的ELISA、Western印跡檢測(cè) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證單抗識(shí)別的保守結(jié)構(gòu)域，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了不含單抗識(shí)別保守結(jié)構(gòu)域的ASP-1截短片段PRM，并采用間接ELISA及Western印跡檢測(cè)單抗是否識(shí)別不含保守結(jié)構(gòu)域的PRM。ELISA分別以ASP-1和PRM為包被抗原，以免疫ASP-1的小鼠陽(yáng)性血清為一抗，陰性血清為對(duì)照，驗(yàn)證陽(yáng)性血清是否和2種蛋白反應(yīng)；然后以單抗為一抗、無(wú)關(guān)腹水抗HA單抗為陰性對(duì)照，驗(yàn)證單抗對(duì)2種蛋白的識(shí)別，檢測(cè)D450nm值，判定標(biāo)準(zhǔn)同上。Western 印 跡 取 ASP-1、PRM 各 0.5 μg 進(jìn) 行 12%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜封閉后，以單抗為一抗，按1∶5000稀釋?zhuān)訦RP-羊抗小鼠IgG為二抗，按1∶8000稀釋?zhuān)没瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組ASP-1在原核系統(tǒng)中的表達(dá)純化及鑒定

重組ASP-1表達(dá)形式以包涵體為主。過(guò)柱純化后，經(jīng)Alphalmager HP掃描軟件掃描，100 mmol/L咪唑洗脫液中目的蛋白占總條帶的99.1%，說(shuō)明純度大于95%（圖1）。用梯度復(fù)性方法復(fù)性，收集蛋白后進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素含量小于0.25 EU/mL，可作為抗原免疫小鼠。

2.2 穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株的篩選

采用雜交瘤技術(shù)及有限稀釋傳代法篩選穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。融合后數(shù)日觀察，大多數(shù)孔出現(xiàn)透亮并聚集生長(zhǎng)的細(xì)胞，篩選出21孔分泌陽(yáng)性抗體的雜交瘤細(xì)胞，選取其中陽(yáng)性值較高者進(jìn)行有限稀釋。在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)220孔內(nèi)有單個(gè)細(xì)胞集落，用間接ELISA篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)其中14個(gè)克隆為陽(yáng)性克隆。亞克隆3次后擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得5株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4株雜交瘤細(xì)胞上清在1/320的稀釋度下，與ASP-1反應(yīng)的D450nm值為1.5以上（上清3-1的D450nm值較低，為0.7，也判斷為陽(yáng)性），而與無(wú)關(guān)蛋白TF反應(yīng)時(shí)D450nm值均在0.1以下（圖2）。說(shuō)明5株雜交瘤細(xì)胞上清僅與ASP-1發(fā)生特異性反應(yīng)，不與無(wú)關(guān)蛋白TF反應(yīng)。

圖1 ASP-1在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

圖2 雜交瘤細(xì)胞上清抗體水平檢測(cè)結(jié)果ASP-1：5株單抗與ASP-1反應(yīng)；無(wú)關(guān)蛋白：5株單抗與無(wú)關(guān)蛋白反應(yīng)

2.3 含抗ASP-1單克隆抗體的腹水效價(jià)測(cè)定及亞類(lèi)鑒定

復(fù)蘇5株雜交瘤細(xì)胞株，注射小鼠腹腔獲得5株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的腹水單抗。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，5株單抗均能和ASP-1蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，其中4株效價(jià)均在106以上，單抗3-1效價(jià)較低，為103，但仍為陽(yáng)性（圖3）。進(jìn)一步做亞類(lèi)鑒定，5株單抗亞類(lèi)均為IgG1，輕鏈均為λ型。

2.4 單克隆抗體識(shí)別區(qū)域的確定

ASP-1屬于CAP蛋白超家族，在空間結(jié)構(gòu)上具有該家族的保守結(jié)構(gòu)域[13]。為進(jìn)一步研究ASP-1的佐劑活性功能區(qū)，對(duì)ASP-1全長(zhǎng)序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，設(shè)計(jì)并合成了8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的單肽，其氨基酸序列及所屬功能域見(jiàn)表1。

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，5株單抗只識(shí)別單肽P2，對(duì)其余7個(gè)單肽均不識(shí)別。單肽P2（21～35 aa）和P3（29～43 aa）的重疊部分為29～35氨基酸殘基，重疊序列是RKKIVGQ，因此這5株單抗的識(shí)別區(qū)域是21～28氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域GGKLTALE（圖4）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證單抗識(shí)別21～28氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了不含21～28 aa的ASP-1截短片段PRM。由于5株單抗均識(shí)別同一區(qū)域，故只用單抗1-1進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的研究。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，ASP-1多克隆陽(yáng)性血清可以和ASP-1、PRM反應(yīng)（圖5A），而單抗1-1不識(shí)別不含21～28 aa的PRM，但識(shí)別ASP-1（圖5B）。說(shuō)明單抗1-1識(shí)別21～28氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域。Western印跡及SDS-PAGE結(jié)果也證明了這一結(jié)論（圖5C、D）。

圖3 單克隆抗體腹水效價(jià)測(cè)定

表1 ASP-1 8個(gè)單肽的氨基酸序列及所屬功能域

圖4 不同單抗與8個(gè)單肽的反應(yīng)檢測(cè)1～5：分別為單抗1-2、2-2、3-1、4-1和7-2；6：陽(yáng)性血清

圖5 ELISA和Western印跡鑒定單抗1-1識(shí)別ASP-1的保守結(jié)構(gòu)域

3 討論

ASP-1作為一種有應(yīng)用前景的微生物來(lái)源的佐劑，具有直接與抗原混合即可發(fā)揮佐劑活性、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)具有Th1型偏倚、可降低聯(lián)合免疫疫苗的使用劑量、平衡免疫應(yīng)答等特點(diǎn)。ASP-1屬CAP［cys?teine-rich secretory proteins（CRISPS），antigen 5（Ag5），and pathogenesis-related 1（Pr-1）］蛋白超家族。該家族的核心區(qū)域是一個(gè)類(lèi)似三明治的空間結(jié)構(gòu)αβα，即3條反向平行的β折疊夾在2個(gè)α螺旋層面之間，其中一個(gè)α螺旋層面由2個(gè)平行的α螺旋構(gòu)成，另一個(gè)層面由單獨(dú)的一條α螺旋構(gòu)成[14-16]。由于ASP-1的免疫原性較強(qiáng)，產(chǎn)生自身抗體后會(huì)使佐劑活性下降，因此降低其免疫原性，同時(shí)保留其佐劑活性有重要意義。單抗作為系統(tǒng)研究ASP-1佐劑活性功能域的有效工具，可在鑒定ASP-1保守結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用方面發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)選擇有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，因?yàn)樵摲ê?jiǎn)單、易操作，易從細(xì)胞群中篩選遺傳穩(wěn)定且同源的細(xì)胞系。經(jīng)過(guò)3次亞克隆后篩選出5株陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，上清效價(jià)在103以上。注射小鼠后獲得5株單抗腹水，除單抗3-1外，效價(jià)均在106以上，亞類(lèi)均為IgG1，輕鏈均為λ型。最終獲得的5株單抗，抗體效價(jià)高，特異性好，但所得單抗數(shù)量少，且均識(shí)別21～28氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)Lasergene軟件的Protean分析，發(fā)現(xiàn)ASP-1的21～28氨基酸殘基是B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，在不加佐劑條件下機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要針對(duì)該表位。

由于5株單抗均識(shí)別同一區(qū)域，故只應(yīng)用單抗1-1進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域的研究，分別與ASP-1、不含21～28 aa保守結(jié)構(gòu)域的PRM蛋白進(jìn)行ELISA，結(jié)果顯示在ASP-1多克隆抗體血清可識(shí)別ASP-1及PRM的情況下，單抗1-1不識(shí)別PRM，但識(shí)別ASP-1。進(jìn)一步驗(yàn)證了單抗1-1識(shí)別ASP-1上21～28氨基酸殘基的保守性結(jié)構(gòu)域GGKLTALE。

綜上，ASP-1單抗的制備，為深入研究ASP-1佐劑活性功能域及其發(fā)揮佐劑活性的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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