劉瑞瑾，吳新榮

廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010

微小染色體維系蛋白3（minichromosome main?tenance 3，MCM3）作為MCM家族的重要一員，與生物體DNA復(fù)制過(guò)程密切相關(guān)。細(xì)胞周期過(guò)程中基因組的復(fù)制調(diào)控對(duì)生物體具有重大意義，在真核生物DNA起始復(fù)制點(diǎn)，預(yù)復(fù)制復(fù)合物（prereplication complex，pre-RC）的形成和破壞是調(diào)控染色體被“許可”進(jìn)入 S 期的關(guān)鍵因子[1-3]。MCM（MCM2～MCM7）是組成pre-RC的蛋白之一，具有保持與維系微小染色體的功能，保證染色體進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)[4]。目前，對(duì)啤酒酵母和哺乳動(dòng)物中MCM3的研究較多。MCM3在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，但在進(jìn)入G0期和分化終止的組織中迅速消失，這些特點(diǎn)使其成為正常組織增殖細(xì)胞的標(biāo)記之一[5-6]。雖然MCM3在正常的增殖細(xì)胞中表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞中，MCM3的表達(dá)水平相對(duì)高于正常組織。Ha等[7]確證，MCM3在幾種人類腫瘤中過(guò)度表達(dá)。MCM3作為一種細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程的特許因子，可作為標(biāo)記物直接反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，對(duì)于因細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失常、失去控制后產(chǎn)生的不典型增生和腫瘤的診斷及預(yù)后都有非常重要的指導(dǎo)意義。斑馬魚具有產(chǎn)卵量高，胚胎體外發(fā)育、透明易于觀察，有較完善的胚胎和遺傳學(xué)操作技術(shù)，品系資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，已被作為一種重要的模式生物廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、藥物學(xué)等方面的研究。通過(guò)序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚的MCM3與小鼠、人高度同源。整胚原位雜交技術(shù)是研究斑馬魚發(fā)育相關(guān)基因的功能和表達(dá)模式的一種重要手段。我們通過(guò)整胚原位雜交方法分析了MCM3的mRNA在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過(guò)程的表達(dá)情況，為深入研究這一基因的功能提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚為Tubingen野生型；感受態(tài)大腸桿菌DH5α由本室保存；TRIzol RNA提取試劑盒購(gòu)自In?vitrogen公司；PrimeScript RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA ladder、限制性內(nèi)切酶及SP6 RNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；Dig RNA Labeling Mix購(gòu)自Roche公司；pGM-T克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA純化試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；顯微操縱儀（Olympus SZX7）；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（Backman）；紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)（DU530，Back?man）；PCR 擴(kuò)增儀（PE9600）；凝膠成像分析系統(tǒng)（EDAS120，KODAK）；多功能恒溫恒壓恒流電泳系統(tǒng)（Pharmacia）；SPX生化培養(yǎng)箱。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)

在NCBI網(wǎng)站上查得MCM3的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)正義引物（5'-TACGC?CAAGCAATGTGAG-3'）和 反 義 引 物（5'-ATAG?CAGTGCGGTCCATA-3'），擴(kuò)增片段長(zhǎng)508 bp，引物由華大基因公司合成。

1.3 總RNA提取

收集受精后24 h（24 hpf）時(shí)期的Tubingen野生型斑馬魚胚胎，脫膜后用TRIzol液溶解，按照TRIzol RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，-70℃保存。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增

按照PrimeScript RT-PCR試劑盒說(shuō)明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以此cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增（95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸60 s，72℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)），瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增的目的基因。

1.5 PCR產(chǎn)物克隆

將回收純化的DNA片段連接到T easy載體上，42℃熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)氨芐西林抗性篩選重組質(zhì)?？寺?，菌落PCR鑒定有目的基因的重組質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序。

1.6 RNA探針合成及純化

將純化的MCM3重組質(zhì)粒用ApaⅠ酶切線性化，異丙醇純化，經(jīng)體外SP6轉(zhuǎn)錄體系轉(zhuǎn)錄，同時(shí)加入地高辛（DIG）標(biāo)記的寡核苷酸，轉(zhuǎn)錄得到DIG-XOX-1反義mRNA探針，-70℃保存。

1.7 斑馬魚整胚原位雜交

參照文獻(xiàn)[8]收集固定斑馬魚胚胎并進(jìn)行整胚原位雜交，在解剖顯微鏡白場(chǎng)下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 小鼠、人和斑馬魚MCM3的同源性分析

根據(jù)已報(bào)道的斑馬魚、小鼠、人的MCM3氨基酸序列，用CLC Sequence Viewer 6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑馬魚的MCM3氨基酸序列與小鼠、人高度同源，表明斑馬魚MCM3的功能可能與人相近（圖1）。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增MCM3基因片段

RT-PCR擴(kuò)增MCM3基因片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，在500 bp附近呈現(xiàn)單一條帶，大小與預(yù)期相符（圖2）。

2.3 斑馬魚整胚原位雜交

解剖鏡下觀察MCM3在斑馬魚胚胎不同時(shí)期的表達(dá)。胚胎受精后0～12 h，MCM3在增殖性區(qū)域泛表達(dá)，表明這一時(shí)期的胚胎細(xì)胞普遍快速增殖，受精后10和12 h，體節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)分別出現(xiàn)；受精后14～22 h，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、發(fā)育未成熟的眼部、體節(jié)及增殖性區(qū)域表達(dá)；受精后24 h，在血液、中樞神經(jīng)、翼板中腦、視覺(jué)蓋及增殖性區(qū)域表達(dá)，并呈現(xiàn)表達(dá)逐漸減弱，說(shuō)明這時(shí)胚胎的細(xì)胞增殖速度已相對(duì)減慢；受精后48 h，在頭部及肛門增殖性區(qū)域表達(dá)（圖3）。

圖1 小鼠、人和斑馬魚MCM3系統(tǒng)進(jìn)化樹圖譜

3 討論

圖2 MCM3基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果M：100 bp DNA ladder；1：MCM3基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

真核生物DNA復(fù)制通過(guò)適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)以確保染色體在一個(gè)細(xì)胞周期中復(fù)制一次。真核細(xì)胞DNA復(fù)制是由復(fù)制點(diǎn)開始的，起始復(fù)制涉及許多蛋白復(fù)合體。在G1期，起始復(fù)制復(fù)合體上結(jié)合有起始識(shí)別復(fù)合體（origin recognition complex，ORC），其作用就像一個(gè)停泊點(diǎn)，供其他調(diào)節(jié)因子停靠，從而使染色體被“許可”進(jìn)入S期。CDC6和CDT1是結(jié)合在ORC上的調(diào)節(jié)因子，其功能是促進(jìn)由6個(gè)亞單位構(gòu)成的MCM復(fù)合體和其他一些蛋白結(jié)合到ORC，形成pre-RC。MCM具有保持與維系微小染色體的功能，而ORC、CDC6和MCM在pre-RC的聚合保證了染色體進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)[9]。

斑馬魚早期發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞快速分裂和增殖，受精后約50 min完成第一次有絲分裂，之后約每間隔15 min分裂一次。以上研究表明，MCM3的表達(dá)與胚胎細(xì)胞的增殖呈明顯的相關(guān)性。作為一種在細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程中的特許因子，MCM3在斑馬魚體內(nèi)可被選為標(biāo)記物，直接反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

圖3 斑馬魚MCM3基因的原位雜交表達(dá)圖譜

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