郝麗娜，胡丹，呂恒，張錦海，張鳳玉，龔秀芳，

李丙軍2，朱進(jìn)2，潘秀珍 2，姚蘋蘋3，張云2，王長軍1，2，陳建華1

1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009；2.南京軍區(qū) 軍事醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南京 210002；

3.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310051

漢坦病毒（Hantavirus，HV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，在我國漢坦病毒主要引起腎綜合征出血熱，臨床上以發(fā)熱、出血和腎損害為主要特征，流行病原主要以漢灘型（HTN）76118株和漢城型（SEO）R22株為主[1-2]。

漢坦病毒是單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由大（L）、中（M）、?。⊿）3個片段組成，分別編碼病毒RNA聚合酶、膜蛋白G1和G2及核衣殼蛋白（NP）[3]。病毒表面的糖蛋白G1和G2是型特異性抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。NP是主要群特異性抗原，比病毒編碼的其他蛋白易于表達(dá)且有更好的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體結(jié)合抗體，在急性感染期NP抗體即可達(dá)到很高的滴度，故常作為診斷用抗原[4]。

我們將HTN型和SEO型病毒編碼NP的S基因克隆至含雙啟動子的PCRⅡ載體，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得含目的基因序列的RNA轉(zhuǎn)錄體，并經(jīng)一步法熒光定量PCR檢測[5]，得到可用于漢坦病毒檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。本研究可為基層快速檢測漢坦病毒方法的建立和改進(jìn)提供陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品，對漢坦病毒致病機(jī)制、基因組功能、疫苗構(gòu)建等研究也有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1～5 d齡的乳沙鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；漢坦病毒HTN型76118株及SEO型R22株為本實驗室保存；載體PCRⅡ-T Vector購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、Ribopmbe System-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；SpeⅠ、SacⅠ內(nèi)切酶、T4DNA聚合酶、250 bp DNA marker、質(zhì)粒提取試劑盒、Prime?Script RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA純化試劑盒、One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒購自TaKa?Ra公司；RNA純化試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 引物合成

根據(jù)GenBank中76118株和R22株的S基因序列設(shè)計擴(kuò)增引物，由上海賽百盛公司合成。引物HTN1P（5'-ATGCATGCGGCCGCTACCATGGCAAC TATGGAGG-3'）和 HTN2P（5'-GATCGTCGACTTA GATCTAGAGTTTCAAAGGCTC-3'）用于擴(kuò)增 76118株S基因（1290 bp），引物SEO1P（5'-GGAATTCCG AAAAATGGCAACTATGGAAGAAA-3'）和 SEO2P（5'-GCTGCAGCACCCGTGATTATACATAGCAGTGA-3'）用于擴(kuò)增R22株S基因（1558 bp）。

1.3 提取RNA

將2株病毒接種1～5 d齡乳沙鼠，每只腦內(nèi)接入0.02 mL，15 d左右收獲發(fā)病小鼠，無菌取腦，研磨腦組織，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，1%瓊脂糖電泳及分光光度計（Onedrop 1000）檢測RNA純度及濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用上、下游引物擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，Taq酶（25 U/μL）0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 16.3 μL，共 25 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，然后以 95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 2 min循環(huán)30次，72℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行T7克隆，并測序。

1.5 測序結(jié)果比對

將測序結(jié)果與GenBank中的相應(yīng)序列用DNA?Star的MegAlign和NCBI上的BLAST在線比對。

1.6 重組質(zhì)粒的線性化及濃度測定

為了獲得確定長度的含插入基因全長序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，須將質(zhì)粒線性化。76118、R22株重組質(zhì)粒分別用SpeⅠ、SacⅠ內(nèi)切酶于37℃消化3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察線性化結(jié)果。用SacⅠ內(nèi)切酶線性化的R22株P(guān)CRⅡ質(zhì)粒3'端突出，用T4DNA聚合酶修復(fù)，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化。用分光光度計測定線性化質(zhì)粒含量。

1.7 體外轉(zhuǎn)錄及模板RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

根據(jù)Riboprobe System-T7試劑盒說明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。室溫配制反應(yīng)體系［5×磷酸鹽緩沖液4 μL，二硫蘇糖醇（DTT，100 mmol/L）2 μL，核酸酶抑制劑（RNasin，40 U）1 μL，核糖核苷三磷酸（rNTP，終濃度各為 0.5 mmol/L）4 μL，線 性 化質(zhì)粒 6 μL，T7RNA聚合酶（18 U）1 μL，無核酸酶的水2 μL，共20 μL］，37℃反應(yīng)1 h；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加1.5 μL脫氧核糖核酸酶（RQ 1 RNase Free DNase，1 U/μL），37℃繼續(xù)反應(yīng)20 min，除去DNA模板；然后用RNA純化試劑盒純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并用分光光度計測定含量。將已測濃度的體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物溶液濃度換算成拷貝/μL。拷貝數(shù)=濃度×阿伏伽德羅常數(shù)/（1個堿基對的平均分子質(zhì)量×總長度），其中阿伏伽德羅常數(shù)為6.02×1023。

1.8 RT-PCR法鑒定體外轉(zhuǎn)錄RNA

將cRNA梯度稀釋至1×1010～1×102拷貝/μL，以各稀釋液為模板進(jìn)行RT-PCR。漢坦病毒通用引物為 HANTAV1U（5'-CWGGVCARACAGCWGAYT-3'）和 HANTAV1L（5'-TCCWGGTGTAADYTCHTCWG C-3'）；探針為 HTN1P（5'-Fam-AGCATCATCGTCT ATCTTACATCC-Tamra-3'）和 SEO1P（5'-Fam-CTA TAATTGTCTATCTAACATCA-Tamra-3'）[5]。反應(yīng)體系包括2×One Step RT-PCR緩沖液10 μL，Ex taq HS（5 U/μL）0.4 μL，PrimeScript RT enzyme Mix 0.4 μL，上 、下 游 引 物 各 0.4 μL，探 針 0.8 μL，ddH2O 5.6 μL，RNA 2 μL。 反 應(yīng) 程 序 ：42℃ 5 min，95℃ 5 s；95℃ 15 s，52℃ 30 s，循環(huán)45次。

2 結(jié)果

2.1 76118、R22株S基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的確認(rèn)

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，目的片段分別約為1.3和1.6 kb，與預(yù)期結(jié)果相符。以重組質(zhì)粒為模板也擴(kuò)增出相應(yīng)大小的目的片段，表明獲得了全長目的片段，且被克隆到PCRⅡ載體（圖1）。

2.2 測序結(jié)果比對

將測序結(jié)果與GenBank中76118和R22株的S基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，克隆的76118、R22株的S基因與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)株基因的序列一致性為99%，證實堿基序列正確，可用于后續(xù)體外轉(zhuǎn)錄等試驗。

2.3 重組質(zhì)粒線性化

76118、R22株重組質(zhì)粒分別經(jīng)SpeⅠ、SacⅠ內(nèi)切酶酶切后得到線性化質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，線性化質(zhì)粒較環(huán)形質(zhì)粒電泳慢，結(jié)果與預(yù)期相符，顯示質(zhì)粒線性化成功（圖2）。

2.4 cRNA標(biāo)準(zhǔn)品的定量

經(jīng)核酸蛋白測定儀測定，體外轉(zhuǎn)錄的76118、R22 株 cRNA 的質(zhì) 量濃 度分 別 為 86.6 和 17.58 ng/μL，D260nm/D280nm值分別為 2.09 和 1.87，符合純度要求。根據(jù)拷貝數(shù)換算公式，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別梯度稀釋至1×1010～1×102拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳1：76118株質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物；2：R22株質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物；M：250 bp DNA marker

2.5 RT-PCR鑒定cRNA標(biāo)準(zhǔn)品

以上述梯度稀釋的 1×1010～1×102拷貝/μL 的cRNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR鑒定，結(jié)果顯示76118和R22株的1×102拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品仍為陽性擴(kuò)增（圖3）。

3 討論

圖2 重組質(zhì)粒線性化對比結(jié)果

圖3 體外轉(zhuǎn)錄cRNA的RT-PCR擴(kuò)增曲線A：76118株S基因體外轉(zhuǎn)錄cRNA的RT-PCR曲線；B：R22株S基因體外轉(zhuǎn)錄cRNA的RT-PCR曲線

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是重要的病毒性傳染病。根據(jù)血清學(xué)研究，引起HFRS的漢坦病毒主要有HTN、SEO、PUU、DOB等血清型，在我國以HTN型和SEO型為主。而且，與布尼亞科其他屬的病毒不同，漢坦病毒可以直接通過嚙齒類的排泄物、呼吸分泌物等接觸感染人[6]。該病為急性傳染病，致死率較高，疫源區(qū)分布廣泛，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[7]。因此，建立模擬病毒RNA的標(biāo)準(zhǔn)品，對腎綜合征出血熱的早期診斷和治療具有重要意義。

漢坦病毒基因組中S片段編碼產(chǎn)物的保守性、抗原性和免疫原性較強(qiáng)，是主要的診斷抗原。我們以漢坦病毒S基因為研究對象，分別構(gòu)建了HTN型76118株和SEO型R22株S片段全長含T7啟動子的重組質(zhì)粒，測序證實質(zhì)粒構(gòu)建成功；經(jīng)T7RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得cRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可作為漢坦病毒的核酸擴(kuò)增快速偵檢技術(shù)方法的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

目前，常用的漢坦病毒檢測方法有血清檢測和基因檢測，其中實時熒光定量PCR的靈敏性高，特異性好，操作簡便，被廣泛應(yīng)用[8-10]。將特異性Taqman探針與目的基因特異性結(jié)合，在Taq酶的外切酶作用下將5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)切下，發(fā)出熒光，大大提高了檢測的靈敏性和特異性[11]。本研究利用探針熒光定量法對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，經(jīng)連續(xù)梯度稀釋，含量換算成拷貝數(shù)為1×1010～1×102拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。相對于質(zhì)粒DNA的檢測，cRNA一步法檢測將RNA的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增一次性完成，避免了對環(huán)境的污染和反轉(zhuǎn)錄過程中的操作誤差，而且操作步驟減少可大大降低樣本RNA的降解，提高檢測結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

我們通過基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄獲得含漢坦病毒S全長基因的cRNA產(chǎn)物，為建立和優(yōu)化漢坦病毒快速檢測提供了陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品，也為后續(xù)開展?jié)h坦病毒的基因功能、疫苗等研究奠定了基礎(chǔ)。

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