李鵬飛，陳堃，修冰水，張慶波，張賀秋

1.河北聯(lián)合大學，河北 唐山 063000；2.軍事醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，北京 100850

腺病毒（adenovirus，Ad）包括1～55血清型[1]，能引起急性腺病毒肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎和急性間質(zhì)性腎炎等多種臨床癥狀[2]。我國常見的呼吸道傳播的腺病毒類型主要為3型、7型[3]。腺病毒可以引起呼吸道感染暴發(fā)，特別是生活在軍隊、學校等封閉環(huán)境內(nèi)的人群[4-5]。2006年，陜西省岐山縣中學暴發(fā)急性呼吸道疾病疫情；2012年2月，河北保定解放軍252醫(yī)院發(fā)生聚集性疫情。經(jīng)鑒定，這2起集中發(fā)熱事件均由腺病毒55型（Ad55）感染所致。Ad55是由Ad11與Ad14基因重組而形成的新型毒株[6]，其臨床表現(xiàn)新特征，如發(fā)熱38.5℃以上、流鼻涕、咽痛、咳嗽、伴有呼吸困難，可能更易于暴發(fā)流行，一度被懷疑為SARS、甲流、禽流感[7]，可引起公眾恐慌。由于缺少有效的針對腺病毒的治療手段和疫苗，因此針對呼吸道癥候群，研制包含Ad55在內(nèi)的廣譜性腺病毒早期快速診斷試劑，對疾病預(yù)警、確定隔離人群，控制疾病傳播具有重要意義。

人腺病毒基因組長約36 kb，其衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，由六鄰體、五鄰體和纖突等蛋白組成復(fù)合結(jié)構(gòu)[8-9]。六鄰體含有型、組和亞組抗原決定簇，是診斷不同血清型的標準[10]。六鄰體含有重要的中和性抗原表位，也是疫苗研究的重要靶點[11]。纖突有血清特異性，且含有體外血細胞凝集的種屬特異性抗原決定位點。有研究顯示，纖突抗體的產(chǎn)生略早于六鄰體[12]，因此，纖突抗原在早期診斷中具有重要地位。由于Ad55發(fā)現(xiàn)較晚，有關(guān)其抗原表位分析尚未見報道。我們用生物信息學技術(shù)預(yù)測了Ad55六鄰體和纖突抗原表位，為研制包括Ad55在內(nèi)的腺病毒血清學檢測和疫苗提供免疫學基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

47份疑似腺病毒呼吸道感染臨床樣本血清由本室保存；48份正常人血清樣本來自北京血站紅十字血液中心；大腸桿菌HB101和表達載體pBVIL-1由本室保存；Taq DNA聚合酶為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ購自Pro?mega公司；配制LB培養(yǎng)基的胰蛋白胨及酵母提取物購自本院條件處；PCR產(chǎn)物回收試劑盒由北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。引物全部由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；DNA序列測定由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 抗原表位分析

從 NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/）下載Ad55的氨基酸序列，運用Biosun生物軟件比對序列，分析六鄰體、纖突的抗原表位情況，確定克隆表達的表位區(qū)間。

1.3 引物設(shè)計與基因合成

根據(jù)抗原表位的氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子設(shè)計并優(yōu)化優(yōu)勢抗原表位區(qū)間的基因（分段設(shè)計并合成引物，采用重疊延伸PCR方法合成各基因片段，并逐步將各片段搭橋擴增，最終得到完整的優(yōu)勢抗原區(qū)間基因）。

1.4 原核表達載體的構(gòu)建

設(shè)計含酶切位點的上下游引物，對上述基因進行PCR擴增，從而在基因片段兩端引入酶切位點，經(jīng)雙酶切后插入經(jīng)同樣酶切的表達載體pBVIL-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，挑選鑒定陽性克隆并測序。

1.5 抗原表達與純化

鑒定出的陽性克隆在37℃培養(yǎng)過夜后，轉(zhuǎn)至新鮮的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3 h，至D600nm值為0.4～0.6，42℃誘導(dǎo)表達4 h以上，離心收集菌體，用TE緩沖液沖洗菌體并懸起，超聲波破碎細胞，離心收集上清，用陰離子交換柱Sephrose 4B和分子篩Sephdex G50純化抗原，SDS-PAGE鑒定各步分離產(chǎn)物。

1.6 間接ELISA法評價Ad55主要抗原表位活性

以純化的Ad55主要抗原表位蛋白包被酶聯(lián)板，用間接ELISA法對疑似患者和正常人血清樣本進行測定，根據(jù)D450nm值計算S/c，評價重組抗原的反應(yīng)活性。

2 結(jié)果

2.1 序列比對與抗原表位選擇

運用Biosun生物軟件預(yù)測Ad55六鄰體、纖突蛋白抗原表位，表位峰值較高的區(qū)段如圖1中橫線所示，Ad55六鄰體含有4個連續(xù)表位（130～190、180～240、230～280和270～322 aa，以下分別稱為表位1～表位4）和2個非連續(xù)表位（410～460和620～680 aa，以下分別稱為表位5、表位6），纖突含有2個主要抗原表位（135～165和210～260 aa，以下分別稱為表位7、表位8），作為克隆表達的目的序列。

2.2 抗原表達與純化

測序結(jié)果顯示基因插入正確。將測序正確的表達菌株進行大量誘導(dǎo)表達，超聲波裂解后的菌懸液幾乎無沉淀，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，8個融合Ad55蛋白為包涵體形式表達，純化后，其純度可達95%以上。

2.3 間接ELISA評價8個融合Ad55蛋白的抗原性

以純化的融合Ad55蛋白包被酶聯(lián)板，用間接ELISA初步檢測48例正常人和47例疑似患者的血清，ROC曲線分析結(jié)果見圖3。其中表位4、5和8的ROC 曲線下面積（AUC）分別為 0.76（P＜0.05）、0.77（P＜0.05）和0.81（P＜0.05），具有一定的診斷意義。

2.4 3種Ad55診斷抗原的變異分析

考慮到腺病毒具有多個血清型，我們對篩選的表位4、5和7等3個Ad55表位與其他血清型之間的變異情況進行了比較，主要篩選了臨床具有呼吸道癥狀，且在我國有流行傳播的3、7、11和14共4種血清型，結(jié)果見表1。篩選的Ad55表位與不同腺病毒血清型之間的序列同源性并不相同，3個Ad55表位均與Ad11相關(guān)表位之間的同源性最高，與Ad3的同源性最低，提示3個表位除了可檢出Ad55外，對Ad11也有相同的檢出能力。表位7除了與Ad3差異較大外，與Ad7、Ad11、Ad14其他型別之間具有較高的同源性；表位5除了與Ad11高度同源外，與Ad3、Ad7、Ad11存在較大差異，是最有可能具有Ad55血清學特異性的抗原。這一結(jié)果提示，可通過一定的抗原組合達到針對多種腺病毒血清型的檢測目的。

圖1 Ad55六鄰體（A）和纖突（B）的抗原表位分析

3 討論

腺病毒在我國上世紀50～60年代出現(xiàn)過大規(guī)模流行，其中兒童感染肺炎死亡率高達30%[13]。沉寂了半個世紀后，近些年國內(nèi)又暴發(fā)了多起腺病毒感染造成的集體發(fā)熱疫情。由于腺病毒引發(fā)的肺炎癥狀并不典型，且對抗生素不敏感，一度被懷疑為SARS、甲流、禽流感等，給公眾造成一定的恐慌，因此，對腺病毒的早期診斷具有重要意義。

圖2 8種Ad55表位抗原的純化M：蛋白marker；1～8：依次為表位1～8

圖3 8種Ad55表位抗原檢測的ROC曲線

表1 Ad55篩選表位氨基酸序列的同源性分析

目前針對腺病毒的檢測主要是基因檢測，具有靈敏度高、能分型等特點[14]，但操作復(fù)雜，儀器昂貴，無法用于基層。20世紀60年代臨床建立的以免疫熒光為主的腺病毒抗原檢測，主要針對3型和7型,往往難以檢測新的腺病毒血清型[15]。本研究針對新發(fā)腺病毒55開展相關(guān)抗原研究，為研發(fā)廣譜性腺病毒免疫學檢測技術(shù)打下基礎(chǔ)。

Ad55是由腺病毒11型與14型基因重組形成的新型毒株[3]，是新發(fā)傳染病原。我們初步用疑似腺病毒感染者血清篩選出3個Ad55抗原表位，序列比較結(jié)果提示Ad55抗原與Ad11高度同源，與Ad3、Ad7的同源性較差。因此，針對Ad3、Ad7的單抗無法識別新發(fā)的Ad55表位，是造成Ad55漏檢的主要原因。本研究獲得的3個表位，特別是135～165 aa表位，與除Ad3型外所有的腺病毒血清型高度同源。因此，補充Ad3型相關(guān)表位，聯(lián)合本研究篩選的表位，能提高檢測腺病毒血清型的覆蓋面，最終為研制包括Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad55在內(nèi)的我國通用性呼吸道癥狀腺病毒的免疫檢測奠定基礎(chǔ)。

[1] Matsushima Y,Shimizu H,Kano A,et al.Novel human ade?novirusstrain，Bangladesh[J]. Emerg Infect Dis, 2012,18(5):846-848.

[2] Athappilly F K,Murali R,Rux J J,et al.The refined crystal structureof hexon,the major coat protein of adenovirus type 2,at 2.9A resolution[J].Mol Biol,1994,30;242(4):430-455.

[3] 辛若雷,包怡華,張勤,等.用抗合成多肽抗體分析呼吸道HAdV六鄰體保守區(qū)抗原表位[J].細胞與分子免疫學雜志,2002,18(5):481-485.

[4] Noda M,Yoshida T,Sakaguchi T,et al.Molecular and epide?miological analyses of human adenovirus type 7 strains isolat?ed from the 1995 nationwide outbreak in Japan[J].Clin Micro?biol,2002,40(1):140-145.

[5] Xu W,Erdman D D.Type-specific identification of human ad?enovirus 3,7,and 21 by a multiplex PCR assay[J].Med Vi?rol,2001,64(4):537-542.

[6] Walsh M P,Seto J,Jones M S,et al.Computational analysis identifies human adenovirus type 55 as a re-emergent acute?respiratory disease pathogen[J].Clin Microbiol,2010,48(3):991-993.

[7] Tang L,Wang L,Tan X J,et al.Adenovirus serotype 7 asso?ciated with a severe lower respiratory tract disease outbreak in infants in Shaanxi Province,China[J].Virol J,2011,8:23.

[8] Cardona C J,Nazerian K,Reed W M,et al.Characterization of a recombinant fowlpox virus expressing the native hexon of hemorrhagic enteritisvirus[J].VirusGenes,2001,22(3):353-361.

[9] Reubel G H,Studdert M J.Identification，cloning and se?quence analysis of the equine adenovirus1 hexon gene[J].Arch Virol,1997,142(6):1193-1212.

[10]Thomson D,Meers J,Harrach B.Molecular confirmation of an adenovirus in brushtail possums(Trichosurus vulpecula)[J].Virus Res.,2002,26;83(1-2):189-195.

[11]Roy S,Shirley P S,McClelland A,et al.Circumvention of im?munity to the adenovirus major coat protein hexon[J].J Virol,1998,72(8):6875-6879.

[12]Yu B,Dong J,Wang C,et al.Characteristics of neutralizing antibodies to adenovirus capsid proteins in human and animal sera[J].Virology,2013,15;437(2):118-123.

[13]Walls T,Shankar A G,Shingadia D.Adenovirus:an increas?ingly important pathogen in paediatric bone marrow transplant patients[J].Lancet Infect Dis,2003,3(2):79-86.

[14]Blyn L B,Hall T A,Libby B,et al.Rapid detection and mo?lecular serotyping of adenovirus by use of PCR followed by electrospray ionization mass spectrometry[J].Clin Microbiol,2008,46(2):644-651.

[15]Shetty A K,Treynor E,Hill D W et al.Comparison of con?ventional viral cultures with direct fluorescent antibody stains for diagnosis of community-acquired respiratory virus infec?tions in hospitalized children[J].Pediatr Infect Dis J,2003,22(9):789-794.