袁菊芳，邱業(yè)峰，王艷靜，李敏，溫珠明，范玉筠，葉華虎

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2.四川省人民醫(yī)院·四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川 成都 610072；3.北京城市學(xué)院，北京 100094

糖尿病是以血糖升高為主要特征的慢性代謝性疾病，隨著病程進(jìn)展，引起全身代謝紊亂，繼發(fā)重要臟器的不可逆損害，其死亡率僅次于腫瘤和心血管病[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)具有降糖作用的植物的多糖化學(xué)和藥理研究進(jìn)展迅速。水母雪蓮為菊科植物水母雪兔子的全草，我國(guó)將其列為三級(jí)保護(hù)植物，具有較高的藥用價(jià)值，對(duì)風(fēng)濕性炎癥、腫瘤、月經(jīng)不調(diào)、白帶增多等病癥的療效明顯[2-4]。水母雪蓮產(chǎn)自海拔4000～6000 m的高寒缺氧、無(wú)污染的雪域地區(qū)，由于其生存環(huán)境特異，生長(zhǎng)速度緩慢，人工栽培困難，加之過(guò)度采挖，目前該物種瀕臨滅絕，嚴(yán)重影響了以雪蓮為主要原料的藥物的開發(fā)與生產(chǎn)。近年來(lái)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所采用生物工程方法，誘變篩選了一株黃酮產(chǎn)量高、培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單、增殖能力較快、遺傳穩(wěn)定的水母雪蓮細(xì)胞突變系[5]。有關(guān)水母雪蓮降血糖方面的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。我們以自發(fā)性糖尿病KKay小鼠為模型，觀察了水母雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞的降血糖作用；同時(shí)，利用糖耐量和血清生化指標(biāo)初步探討了其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性KKay小鼠及高脂飼料均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所（質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK京2009-0004）；水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供；鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）；日立7600型全自動(dòng)生化分析儀（日立公司）；One Touch血糖儀及血糖試紙（強(qiáng)生公司）；血清胰島素由解放軍總醫(yī)院原子能研究所采用放射免疫法測(cè)定。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

KKay小鼠由專用高脂飼料飼喂，待動(dòng)物生長(zhǎng)到10～12周齡，用血糖試紙測(cè)定血糖含量，選取血糖值在14.5 mmol/L以上的為糖尿病模型小鼠。依據(jù)動(dòng)物體重和血糖值指標(biāo)，隨機(jī)分為3組，每組10只。3組動(dòng)物分別灌胃水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物（100 mg/kg）、二甲雙胍（250 mg/kg）和生理鹽水（0.2 mL/10 g），每天1次，每周給藥6 d。

1.3 血糖值測(cè)定

每周測(cè)定動(dòng)物血糖并稱重。在測(cè)定血糖前，動(dòng)物先禁食3 h（不禁水），然后給藥，繼續(xù)禁食3 h，斷尾取血，用血糖儀測(cè)定動(dòng)物的血糖。

1.4 糖耐量實(shí)驗(yàn)

將連續(xù)灌胃6周的KKay小鼠先禁食3 h，測(cè)量空腹血糖（計(jì)為0點(diǎn)），然后按劑量一次性灌胃雪蓮、二甲雙胍和等量生理鹽水，給藥后30 min腹腔注射50%葡萄糖（2 g/kg），分別在注射葡萄糖后30、60、120 min測(cè)量血糖，并計(jì)算曲線下面積（AUC）。AUC=1/4×空腹血糖＋1/2×30 min血糖＋3/4×60 min血糖＋120 min血糖。

1.5 藥物的時(shí)-效關(guān)系測(cè)定

將連續(xù)灌胃6周的KKay小鼠在不禁食環(huán)境下一次性給藥，分別于給藥后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h測(cè)量血糖。

1.6 血清生化指標(biāo)測(cè)定

模型小鼠連續(xù)給藥6周，末次給藥后空腹3 h，摘眼球取血，分離血清，用全自動(dòng)生化儀測(cè)定總膽固醇（CH）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU），用放射免疫法測(cè)定血清胰島素。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)KKay糖尿病小鼠體重的影響

3組動(dòng)物體重隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增重，其中對(duì)照組動(dòng)物體重增加幅度最大，二甲雙胍組次之，雪蓮組動(dòng)物增加幅度最小。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，從給藥后第2周開始，水母雪蓮組動(dòng)物體重明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），而2個(gè)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的體重差異不明顯。

2.2 雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)KKay糖尿病小鼠血糖的影響

3組動(dòng)物給藥后的血糖測(cè)定結(jié)果顯示，對(duì)照組動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間血糖值一直維持在高水平狀態(tài)（14.91±1.21～17.85±2.08 mmol/L），而水母雪蓮組和二甲雙胍組動(dòng)物在給藥7 d后，血糖值明顯下降，且持續(xù)維持在較低水平（二甲雙胍組為 7.30±1.36～8.02±1.12 mmol/L，水母雪蓮組為 8.95±0.71～9.51±1.36 mmol/L）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，給藥1周后，水母雪蓮組和二甲雙胍組動(dòng)物的血糖值相當(dāng)，都顯著低于對(duì)照組（P＜0.01)。

表1 水母雪蓮對(duì)KKay小鼠體重的影響（x±s，n=10）

表2 飼喂水母雪蓮后3 h小鼠的空腹血糖（x±s，n=10）

2.3 雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)KKay小鼠的血糖值變化

藥物的時(shí)-效關(guān)系測(cè)定結(jié)果顯示，對(duì)照組動(dòng)物在20 h內(nèi)持續(xù)處于高血糖水平（血糖值為18.38±1.82～23.43±3.01 mmol/L），而雪蓮組和二甲雙胍組動(dòng)物都出現(xiàn)“U”形變化趨勢(shì)，即在給藥后一段時(shí)間血糖值下降，在低血糖水平維持一段時(shí)間，最后再升高。其中，二甲雙胍在給藥后2 h即可見(jiàn)血糖明顯下降，6 h血糖值最低（為7.26±1.80 mmol/L），14 h后逐漸恢復(fù)到藥前水平；雪蓮組動(dòng)物的血糖值明顯下降出現(xiàn)在藥后6 h，14 h達(dá)到最低（為5.95±1.25 mmol/L），20 h左右逐漸恢復(fù)到給藥前水平（圖1）。

2.4 雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)KKay糖尿病小鼠糖耐量的影響

3組動(dòng)物的糖耐量測(cè)定結(jié)果顯示，水母雪蓮組動(dòng)物空腹3 h的血糖值最低，二甲雙胍組次之，對(duì)照組最高，且3組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。注射葡萄糖后，3組動(dòng)物血糖值高點(diǎn)都出現(xiàn)在注射后30 min，此后血糖值開始下降，對(duì)照組在120 min時(shí)逐漸降到給藥前水平，而水母雪蓮組和二甲雙胍組的血糖值呈繼續(xù)下降態(tài)勢(shì)。提示水母雪蓮組和二甲雙胍組動(dòng)物的糖代謝能力得到顯著改善（P＜0.01）。

2.5 雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)KKay糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響

3組動(dòng)物的4項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果顯示，雪蓮組動(dòng)物的血糖、甘油三酯、膽固醇和血清胰島素水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；二甲雙胍組動(dòng)物的血糖和甘油三酯水平也低于對(duì)照組（P＜0.01），但膽固醇和血清胰島素水平與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

圖1 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物血糖變化與對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01

表3 不同實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=10）

表4 水母雪蓮對(duì)KKay小鼠4項(xiàng)生化指標(biāo)的影響（x±s，n=10）

雪蓮是名貴中藥材，我國(guó)利用雪蓮已開發(fā)出了多種中成藥、保健性食品（飲品）、美容及護(hù)膚品。鑒于雪蓮自然產(chǎn)量的減少和不足，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所胡顯文課題組建立了雪蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，實(shí)現(xiàn)了雪蓮細(xì)胞的人工培育，同時(shí)利用生物工程技術(shù)誘變并定向篩選獲得高黃酮含量的穩(wěn)定突變細(xì)胞系。功能研究初步發(fā)現(xiàn)，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物有明顯的血脂調(diào)節(jié)作用，并具有糖代謝調(diào)節(jié)功能。

為了進(jìn)一步研究雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的降糖作用及其可能的作用機(jī)制，我們以國(guó)內(nèi)外廣泛使用的Ⅱ型糖尿病模型動(dòng)物KKay小鼠[6-7]為對(duì)象，通過(guò)多種指標(biāo)測(cè)試，評(píng)價(jià)了雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的降糖效果，并探索其可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，雪蓮細(xì)胞具有明顯的降糖作用。KKay小鼠飼喂雪蓮7 d后，動(dòng)物的血糖值明顯下降，且在此后的5周時(shí)間內(nèi)一直維持在較低水平（8.95±2.71～9.52±2.88 mmol/L），其效應(yīng)與陽(yáng)性藥物二甲雙胍類似（7.30±1.36～8.02±2.12 mmol/L）；而在此期間，生理鹽水對(duì)照組動(dòng)物的血糖值波動(dòng)于14.91±2.11～17.85±2.08 mmol/L，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P＜0.01)。另外，我們發(fā)現(xiàn)如空腹時(shí)間短（＜5 h），小鼠的血糖值變化幅度較大，6～8 h處于相對(duì)平穩(wěn)期，超過(guò)8 h變化幅度又將增加（該部分?jǐn)?shù)據(jù)未顯示），因此以空腹6 h作為血糖測(cè)定的最佳時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的降糖作用具有起效時(shí)間長(zhǎng)、作用持久等明顯的中藥特點(diǎn)。給連續(xù)灌胃6周的動(dòng)物一次性給藥，測(cè)定動(dòng)物20 h內(nèi)的血糖變化，結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組血糖值持續(xù)處于高水平（18.38±1.82～23.43±3.01 mmol/L）；而雪蓮細(xì)胞組動(dòng)物的血糖值變化呈“U”字形，即給藥后6 h開始下降，14 h達(dá)最低（5.95±1.25 mmol/L），20 h左右逐漸恢復(fù)到給藥前水平；陽(yáng)性藥物二甲雙胍的變化態(tài)勢(shì)與雪蓮細(xì)胞組相似，但其效應(yīng)快于雪蓮組，即給藥后2 h血糖開始下降，6 h血糖值最低（7.26±1.80 mmol/L），14 h后逐漸恢復(fù)到給藥前水平。

糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雪蓮細(xì)胞組和二甲雙胍組動(dòng)物的糖代謝能力得到明顯改善，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的AUC值分別為40.79±3.33和31.48±2.70，顯著低于對(duì)照組的56.32±4.07。血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，雪蓮細(xì)胞組動(dòng)物的血清胰島素水平由對(duì)照組的101.91±12.23 μU/mL 下降到 74.86±8.96 μU/mL，該指標(biāo)也低于二甲雙胍組的 93.73±10.19 μU/mL（P＜0.05）。此外，雪蓮細(xì)胞組動(dòng)物的血清甘油三酯和膽固醇水平也明顯下降。上述結(jié)果表明，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物能有效提高胰島素的敏感性，降低胰島素抵抗，從而達(dá)到降糖作用；同時(shí)也提示雪蓮細(xì)胞有明顯的脂肪代謝調(diào)節(jié)功能，與楊波的前期報(bào)道類似[8]。

糖和脂肪代謝雖然各有其主要途徑，但在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，糖和脂肪代謝又相互關(guān)聯(lián)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物既通過(guò)提高胰島素的敏感性調(diào)節(jié)糖代謝，又可調(diào)節(jié)血脂代謝。但雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的降糖作用是通過(guò)胰島素途徑（降低胰島素抵抗或提高胰島素敏感性），還是通過(guò)血脂代謝間接影響血糖，或者是二者的共同作用結(jié)果，還有待于進(jìn)一步的研究。

[1]李繼紅.甘精胰島素治療口服降糖藥控制不良的2型糖尿病療效分析[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2008,28(1):161.

[2] 萬(wàn)明,劉建.天山雪蓮花研究開發(fā)前景[J].新疆中醫(yī)藥,2004,22(4):60-61.

[3] 蔡紹輝,唐瓊,陳嘉任,等.復(fù)方雪蓮燒傷青促創(chuàng)面愈合抗炎作用研究[J].中成藥,1999,21(5):243.

[4] 韓書亮.雪蓮四種成分抗癌作用研究[J].癌變·畸變·突變,1995,7(2):80.

[5] 高麗華,胡顯文,劉波,等.鈣、磷、鎂和鉀對(duì)雪蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響[J].生物技術(shù)通訊,2003,14(5):396-398.

[6] Diani A R,Sawada G A,Zhang N Y,et al.The KKAy mouse:a model for the rapid development of glomerular capil?lary basement membrane thickening[J].Blood Vessels,1987,24(6):297-303.

[7] Ikarashi N,Toda T,Okaniwa T,et al.Anti-obesity and antidiabetic effects of acacia polyphenol in obese diabetic KKAy mice fed high-fat diet[J].Evid Based Complement Alternat Med,2011,2011:952031.

[8] 楊波,李天德,胡顯文,等.水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物調(diào)血脂作用的初步研究[J].生物技術(shù)通訊,2005,16(1):46-47.

[9] Abdollahi M,Farshchi A,Nikfar S,et al.Effect of chromium on glucose and lipid profiles in patients with type 2 diabe?tes;a meta-analysis review of randomized trials[J].J Pharm Pharm Sci,2013,16(1):99-114.

[10]Bardini G,Rotella C M,Giannini S.Dyslipidemia and diabe?tes:reciprocal impact of impaired lipid metabolism and Betacell dysfunction on micro- and macrovascular complications[J].Rev Diabet Stud,2012,9(2-3):82-93.