郭紫芬，軒貴平，陳方方，張式一

南華大學(xué) 藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001

定點(diǎn)突變是分子生物實(shí)驗(yàn)常用的技術(shù)之一[1]，目前實(shí)驗(yàn)室研究常規(guī)使用試劑盒進(jìn)行定點(diǎn)突變，如Ta?KaRa公司的多點(diǎn)突變?cè)噭┖衃2]、Stratagene公司的定點(diǎn)突變?cè)噭┖衃3]。試劑盒不僅價(jià)格較昂貴，技術(shù)要求程度相對(duì)較高，且具體的突變效率也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。重疊延伸PCR技術(shù)（splicing by overlap exten?sion PCR，SOE PCR）是一種特殊的PCR技術(shù)，該技術(shù)采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。因此，此技術(shù)能在體外進(jìn)行有效的基因拼接、重組，在基因的定點(diǎn)突變方面有著廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用[4-11]。但傳統(tǒng)的重疊延伸PCR技術(shù)需要依靠瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，此過程繁瑣、不經(jīng)濟(jì)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用重疊延伸PCR技術(shù)結(jié)合冷凍析出目的片段的方法，減少了繁瑣的瓊脂糖凝膠回收步驟，同時(shí)設(shè)計(jì)的點(diǎn)突變引物使突變位點(diǎn)位于引物中間位置，且上下游引物完全互補(bǔ)，使引物設(shè)計(jì)更加方便，突變成功率也有所保證，節(jié)省了大量時(shí)間，突變效率高，能一次實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的突變，方便廉價(jià)，目前不失為一種值得推廣的節(jié)約資源的多位點(diǎn)突變方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5ɑ為本實(shí)驗(yàn)室保存；野生型質(zhì)粒模板是將人線粒體基因中包含熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的基因片段插入T載體，且經(jīng)測序確證序列，用質(zhì)粒提取試劑盒提取野生型質(zhì)粒作為模板，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)不相鄰三位點(diǎn)的同時(shí)突變，為試驗(yàn)前期工作結(jié)果。質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱形）Plasmid Mini KitⅠ購自O(shè)mega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System購自Promega公司；高保真度Pfx DNA聚合酶購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ，10×M緩沖液、10×上樣緩沖液購自TaKaRa公司。

1.2 引物合成

利用Muta Primer 2.0設(shè)計(jì)3對(duì)定點(diǎn)突變引物，突變位點(diǎn)分別位于人線粒體基因的961、1494和1555位，且均在引物的中間位置，每對(duì)引物均為完全互補(bǔ)引物；同時(shí)合成pMD-19T載體的一對(duì)通用引物。引物序列見表1。

1.3 單重PCR反應(yīng)

以野生型質(zhì)粒為模板，引物如表2所示，進(jìn)行高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的雙向引物延伸反應(yīng)，分別得到A、B、C、D共4段PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系包括模板1 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，50 mmol/L MgSO40.5 μL，Enhanced 緩沖液1.25 μL，Pfx酶0.5 μL，10×Pfx酶緩沖液2.5 μL，加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，55℃退火 30 s，68℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán)；4℃降溫。

用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測A、B、C、D各段，分別切下含各目的片段的膠條，于-80℃冷凍20 min后，于4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清析出液作為模板，進(jìn)行重疊PCR。

1.4 重疊PCR反應(yīng)

分別取單重PCR的冷凍析出液2 μL混合，作為模板將2段融合，引物與模板的組合如表3，其他反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同單重PCR，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，證實(shí)為兩目的片段并同單重PCR進(jìn)行冷凍析出。取重疊PCR產(chǎn)物A+B、C+D段的冷凍析出液各2 μL混合作為模板，以RVM、M13為引物，按單重PCR體系和條件再次進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收重疊PCR產(chǎn)物，即融合片段A+B+C+D段。

1.5 突變目的片段的體外重組

將回收的突變目的片段用HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切，與經(jīng)相同酶切的野生型質(zhì)粒模板連接，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)于含100 μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆陽性菌落過夜振蕩培養(yǎng)，并以RVM和M13為引物，通過菌液PCR法鑒定陽性克隆，取陽性克隆的菌液交上海生工生物工程公司測定其基因序列。

2 結(jié)果

2.1 重疊延伸PCR反應(yīng)

通過單重PCR擴(kuò)增得到A、B、C、D共4個(gè)PCR片段，與各段預(yù)計(jì)目的片段A（251 bp）、B（530 bp）、C（82 bp）、D（242 bp）大小一致（圖1）。通過重疊PCR得到融合A+B段、C+D段和融合全長目的片段，也與預(yù)計(jì)目的片段A+B段（781 bp)、C+D段（324 bp）和融合全長（1105 bp）大小一致（圖2）。

2.2 突變目的片段的體外重組

全長突變目的片段與野生質(zhì)粒模板的HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切結(jié)果如圖3，各條帶位置正確?；厥彰盖心康钠魏唾|(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取12個(gè)單克隆陽性菌落，振蕩培養(yǎng)，得到10管單克隆陽性菌液，分別用M13和RVM引物進(jìn)行菌液PCR初步篩選，得到轉(zhuǎn)化成功的陽性菌液8管。取PCR反應(yīng)陽性的菌液各1 mL，交上海生工生物工程公司進(jìn)行基因測序，結(jié)果經(jīng)Blast同源性分析，表明6個(gè)樣本同時(shí)包含3個(gè)定點(diǎn)突變位點(diǎn)，而其他2個(gè)樣本同時(shí)出現(xiàn)了1個(gè)非定點(diǎn)突變位點(diǎn)。突變成功的部分測序結(jié)果如圖4。

表1 重疊延伸PCR引物序列

表2 單重PCR各段引物名稱

表3 重疊PCR反應(yīng)引物與模板

3 討論

圖1 單重PCR擴(kuò)增各片段

圖2 重疊PCR擴(kuò)增各片段

目前的多點(diǎn)突變?cè)噭┖袑映霾桓F。TaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit的原理，是設(shè)計(jì)合成同一方向的錨定引物及定點(diǎn)突變引物，將錨定引物及定點(diǎn)突變引物用T4多聚核苷酸激酶磷酸化后與模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行退火，再用T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶進(jìn)行延伸和連接形成突變單鏈，然后用錨定引物“尾巴”上的特異性引物（ETail F/ETail R）和高保真DNA聚合酶PrimeSTAR對(duì)突變單鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的雙鏈PCR產(chǎn)物克隆回原載體中，即可達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，獲得目的突變體。本實(shí)驗(yàn)室曾3次運(yùn)用該試劑盒進(jìn)行三位點(diǎn)突變，結(jié)果3次的測序結(jié)果均顯示無任何定點(diǎn)突變產(chǎn)生。其原因可能是定點(diǎn)突變引物同錨定引物與質(zhì)粒退火過程不能保證所有引物均與模板相連，從而導(dǎo)致突變位點(diǎn)的引入困難。應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)，采用突變位點(diǎn)位于引物中間位置的完全互補(bǔ)引物，PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物也必定包含引物上的突變位點(diǎn)，相比傳統(tǒng)的突變位點(diǎn)位于引物兩端而言，既能方便引物設(shè)計(jì)，又能保證突變位點(diǎn)的順利引入，提高突變效率。同時(shí)，采用冷凍析出法代替各步PCR產(chǎn)物回收，是考慮到PCR需要的模板量相對(duì)較少。也有用上一步PCR產(chǎn)物直接作為模板進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)的[12]，但PCR產(chǎn)物中有酶、引物和質(zhì)粒模板，會(huì)使非特異性擴(kuò)增幾率加大，也可能會(huì)干擾重疊PCR反應(yīng)條件，使產(chǎn)物特異性下降。對(duì)于剩余引物的干擾問題，雖然有學(xué)者提出不對(duì)稱PCR解決方法，但該方法過于繁瑣，需要反復(fù)優(yōu)化條件[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用切膠條冷凍析出法，切下的只是包含單重PCR目的條帶的部分，經(jīng)-80℃快速冷凍，離心析出，可方便快捷地得到少量目的產(chǎn)物，作為模板既能保證特異性和需要量，又能使PCR反應(yīng)更易調(diào)控。因此，這種改進(jìn)的重疊延伸PCR構(gòu)建同時(shí)包含多位點(diǎn)突變質(zhì)粒，相比本實(shí)驗(yàn)室前期所應(yīng)用的試劑盒，具有高效、廉價(jià)、突變特異性高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又簡便于傳統(tǒng)的重疊延伸PCR技術(shù)，值得在分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更高的使用價(jià)值。

圖3 質(zhì)粒與融合全長片段的雙酶切

圖4 質(zhì)粒載體部分測序結(jié)果比對(duì)圖A、B、C：前期構(gòu)建的野生型質(zhì)粒；D、E、F：本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的突變型質(zhì)粒D：1555位T突變?yōu)镃；E：1494位G突變?yōu)锳；F：961位缺失A

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