周學(xué)興 張 彬

（1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.雅安三九藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000）

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜法研究參附注射液中的核苷類成分*

周學(xué)興1張 彬2△

（1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.雅安三九藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000）

目的對(duì)參附注射液中核苷類成分進(jìn)行研究。方法采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS），以乙腈-水（用冰醋酸調(diào)pH至2.65）為流動(dòng)相梯度洗脫，以Waters symmetry shieldTMRP18色譜柱為分析柱，通過電噴霧電離源（ESI），選擇正離子模式全掃描方式檢測(cè)，對(duì)參附注射液中核苷類成分進(jìn)行分析鑒定。采用高效液相色譜法（HPLC），以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，以Phenomenex Gemini 5 μ C18色譜柱為分析柱，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，對(duì)所鑒定的核苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果參附注射液中檢測(cè)到尿苷（Uridine）、鳥苷（Guanosine）、腺苷（Adenosine）3種核苷類成分。HPLC測(cè)定3種核苷類成分精密度良好（RSD＜1.0％），平均回收率為97.2％～98.7％，RSD＜1.0％（n=6），在選定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9998）。結(jié)論參附注射液中含有尿苷、鳥苷、腺苷3種核苷類成分，用HPLC測(cè)定3種核苷類成分方法可靠。

參附注射液 核苷 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 高效液相色譜法

參附注射液是依據(jù)宋代嚴(yán)用和《濟(jì)生方》參附湯研制成的現(xiàn)代中藥制劑，具有回陽(yáng)救逆，益氣固脫功能，主治陽(yáng)氣暴脫的厥脫癥（感染性、失血性、失液性休克等），也可用于陽(yáng)虛（氣虛）所致的驚悸、怔忡、喘咳、胃疼、泄瀉、痹證等。參附注射液由紅參、附片經(jīng)提取、精制、配制、灌封、滅菌制成。對(duì)于參附注射液中人參皂苷類、生物堿類、糖類等成分早已有研究及文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)于其中核苷類物質(zhì)的研究尚未查到。為此，筆者通過高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)本產(chǎn)品中極性較大的物質(zhì)成分進(jìn)行研究，鑒定出了參附注射液中尿苷（Uridine）、鳥苷（Guanosine）、腺苷（Adenosine）等核苷類成分，其中，腺苷可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時(shí)還參與擴(kuò)張冠脈血管，增加血流量，對(duì)心血管系統(tǒng)和肌體的其他系統(tǒng)及組織均有生理作用。腺苷和鳥苷由紅參提供，尿苷由附片提供。同時(shí)，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定尿苷、鳥苷、腺苷3個(gè)成分含量的方法［1-7］。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

METTLER TOLEDO AE-240電子天平（梅特勒-托利多公司）、Thermo LCQ FLEET高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀及Xcalibur軟件（賽默飛世爾科技公司）、Waters e2695高效液相色譜儀和Waters 2998二級(jí)陣列管檢測(cè)器、Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀及ChemStation化學(xué)工作站。

1.2 對(duì)照品

尿苷（Uridine，99％，Lot：A017402701，C.A.S.：58-96-8，ACROS ORGANICS，New Jersey，USA）、 鳥苷（Guanosine，99％，Lot A018147001，C.A.S.118-00-3，ACROS ORGANICS，New Jersey，USA）、腺苷（Adenosine，110879-200202，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

1.3 試劑

乙腈（色譜純，Merck），試驗(yàn)用水為純化水。

1.4 藥物

參附注射液為雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（規(guī)格為 10 mL/支，批號(hào)分別為 Z-100402、Z-100403、Z-100404、Z-100405、Z-100406、Z-100703；規(guī)格為50 mL/瓶，批號(hào)為Z-100702）。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定參附注射液中尿苷、鳥苷、腺苷成分

2.1.1 色譜-質(zhì)譜條件［8-10］色譜柱Waters symmetry shieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），柱溫30℃；樣品盤溫度30℃，進(jìn)樣量10 μL；以水（用冰醋酸調(diào)pH值2.65）為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，按0 min，流動(dòng)相A100％，30 min流動(dòng)相A90％、流動(dòng)相B10％進(jìn)行梯度洗脫；UV檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；PDA掃描200～600 nm。離子化方式：電噴霧離子源（ESI）；質(zhì)量分析器：離子肼。掃描方式：50～2000 m/z全掃描一級(jí)質(zhì)譜（full scan）和選擇離子二級(jí)掃描質(zhì)譜（SIM）244 m/z（尿苷［′M+H］）；283 m/z（鳥苷［′M+H］）；268 m/z（腺苷［′M+H］）等方式。掃描模式：正離子模式。ESI源溫度：350℃；噴霧電壓35 V。

2.1.2 溶液的制備 取腺苷對(duì)照品、鳥苷對(duì)照品和尿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1 mL各含20 μg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液的制備。取參附注射液作為供試品溶液。

2.1.3 結(jié)果 采用上述液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)得參附注射液中尿苷、鳥苷、腺苷色譜圖、PDA圖、總離子流圖（TIC）。

2.2 參附注射液中尿苷、鳥苷、腺苷含量測(cè)定

鑒于2.1條件下質(zhì)譜圖中各分子離子峰明顯，但色譜圖中鳥苷峰和腺苷峰分離不好，故另建分離度好的色譜方法進(jìn)行含量測(cè)定，方法見2.2。

圖1 尿苷、鳥苷、腺苷色譜圖、PDA圖、總離子流圖（TIC）

表1 重復(fù)性試驗(yàn)

圖2 尿苷、鳥苷、腺苷含量測(cè)定色譜圖

2.2.1 色譜條件 色譜柱 Phenomenex Gemini C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm［4-9］；以水為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B［4-5］，按0～7 min流動(dòng)相A 98％、流動(dòng)相B 2％、流速1.000 mL/min，7.01～30 min流動(dòng)相A96％、流動(dòng)相B4％、流速1.000 mL/min進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 溶液的制備 取尿苷、鳥苷、腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1 mL分別約含20 μg、8 μg、20 μg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取參附注射液作為供試品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取含尿苷20.84 μg/mL、鳥苷8.304 μg/mL、腺苷20.92 μg/mL的對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算RSD值分別為0.20％、0.40％、0.13％（n=6）。以腺苷峰計(jì)理論塔板數(shù)均大于10000。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 見表1。取參附注射液Z-120405共6份分別作為供試品溶液，以含尿苷20.84 μg/mL、鳥苷8.304 μg/mL、腺苷20.92 μg/mL的對(duì)照品混合溶液為外標(biāo)，測(cè)定，以含量計(jì)算RSD值均小于1.0％，表明方法重復(fù)性好。

2.2.5 中間精密度及供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述供試品溶液樣A于室溫（23℃）下放置，分別于0、6、

12、24、48 h測(cè)定。含量在48 h內(nèi)無明顯變化，表明供試品溶液在48 h內(nèi)是穩(wěn)定的。以含量計(jì)算RSD值均小于1.0％，表明方法精密度好。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下的方法操作，配制成含尿苷 20.84 μg/mL、鳥苷8.304 μg/mL、腺苷20.92 μg/mL的對(duì)照品混合溶液，分別精密吸取6份對(duì)照品溶液各1～2 mL容量瓶中，分別精密加入?yún)⒏阶⑸湟篫-120405供試品1 mL，分別混勻，即得。照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件各進(jìn)樣10 μL，按外標(biāo)法計(jì)算供試液濃度，并計(jì)算回收率（n=6）為97.2％～98.7％及RSD值均小于1.0％，表明該方法準(zhǔn)確度高。

表2 加樣回收試驗(yàn)

2.2.7 線性關(guān)系考察 按“2.2.2”項(xiàng)下分別配制成如下表濃度不等的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件各進(jìn)樣10 μL，以對(duì)照品溶液的濃度Y（μg/mL）對(duì)峰面積X（AU）進(jìn)行線性回歸分析。尿苷回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=0.065x+0.0415，R2=0.9999。鳥苷回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=0.0724x-0.2692，R2=0.9998。腺苷回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=0.0324x-0.2473，R2= 0.9998。結(jié)果表明。尿苷在2.61～333.44 μg/mL、鳥苷在1.04～132.864 μg/mL、腺苷在2.62～334.72 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.8 耐用性試驗(yàn) 保持其他色譜條件不變，分別改變下述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)：（1）改變流速為 0.7 mL/min、1.0 mL/min、1.3 mL/min；（2）改變柱溫為25℃、30℃、35℃；（3）改變色譜柱品牌及型號(hào)為Waters symmetry shieldTMRP18 （4.6 mm×250 mm；5.0 μm）、Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）、Phenomenex Gemini 5μ C18（110 A 250 mm×4.6 mm 5 micron）、Phenomenex Synergi 4μHydro-RP80A（110 A 250 mm×4.6 mm 4 micron）；（4）改變儀器品牌及型號(hào)為Waters e2695、Agilent 1100、DIONEX U-3000。

由系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)得知該方法對(duì)流速、柱溫、儀器品牌及型號(hào)無選擇性，用其中任何一種都能達(dá)到分離效果并滿足檢測(cè)需求；但對(duì)色譜柱有選擇性，使用Phenomenex Gemini 5μ C18（110 A 250 mm×4.6 mm 5micron）色譜柱才能達(dá)到很好的分離效果，因此將色譜柱型號(hào)規(guī)定于檢測(cè)方法色譜條件中。

3 討論

本研究中尿苷、鳥苷、腺苷相對(duì)分子質(zhì)量較小，采用離子肼質(zhì)譜進(jìn)行小分子物質(zhì)二級(jí)掃描時(shí)不容易被打碎?？赡苁怯捎陔x子肼進(jìn)行二級(jí)打碎掃描時(shí)實(shí)際上仍是采取scan掃描方式，只是這次掃描范圍比一級(jí)掃描（full scan）范圍更窄，它在打碎母離子的同時(shí)一部分能量也會(huì)打碎范圍內(nèi)的其他離子，實(shí)際能量很弱，打出的碎片很多很復(fù)雜，信號(hào)強(qiáng)度也弱，靈敏度也低，故離子肼用作尿苷、鳥苷、腺苷這3個(gè)小分子量成分的MS/MS二級(jí)掃描檢測(cè)效果不理想。今后可以改用三重四級(jí)桿質(zhì)譜作這類小分子量物質(zhì)成分的MS/MS二級(jí)質(zhì)譜分析針對(duì)性會(huì)更強(qiáng)一些。

本研究通過UV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)尿苷、鳥苷、腺苷3個(gè)成分，檢測(cè)用254 nm波長(zhǎng)比203 nm波長(zhǎng)噪聲更??；由于3種成分均為核苷類成分，PDA掃描發(fā)現(xiàn)3種成分光譜圖基本一致，且最大吸收都在260 nm波長(zhǎng)處。由此，建立含量測(cè)定方法時(shí)選擇260 nm作為UV檢測(cè)波長(zhǎng)。筆者通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出參附注射液中尿苷、鳥苷、腺苷成分，建立了參附注射液中尿苷、鳥苷、腺苷含量同時(shí)測(cè)定的方法，并經(jīng)過方法驗(yàn)證：該方法重復(fù)性好、精密度好、回收率（n=6）均大于97.0％、尿苷在2.61～333.44 μg/mL、鳥苷在1.04～132.864 μg/mL、腺苷在2.62～334.72 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好、該方法對(duì)流速、柱溫、儀器品牌及型號(hào)無選擇性，對(duì)色譜柱有選擇性。該方法用于參附注射液中尿苷、鳥苷、腺苷含量同時(shí)測(cè)定準(zhǔn)確可靠。

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Nucleosides in Shenfu injection by LC-MS and HPLC

ZHOU Xuexing，ZHANG Bin.College of Chemical Engineering，Sichuan University，Sichuan，Chengdu 610065，China

Objective：To study nucleosides in Shenfu injection.Methods：Nucleosides in Shenfu injection were identified by LC-MS.The separation was performed on Waters symmetry shieldTM RP18 column.Gradient elution was carried out with mobile phase consisting of acetonitrile-water（adjusted pH=2.65 with acetic acid）.Electrospray ionization source was applied and operated in the positive ion mode.Three nucleosides in Shenfu injection were simultaneously determined by high performance liquid chromatography（HPLC）with Phenomenex Gemini 5μ C18 column.Gradient elution was carried out with mobile phase consisting of acetonitrile-water at the flow rate of 1.0 mL/min.The assay was carried out at 30℃with detection at 260 nm.Results：Adenosine，guanosine and uridine in Shenfu injection were identified.The relationship between the injection quality and the peak areas of the three nucleosides was all linear.The precisions were better and the RSDS were less than 1.0％.The average recoveries（n=6）were in the range of 97.2％～98.7％and the RSDS were all less than 1.0％.Conclusion：There are three nucleosides in Shenfu injection.The method is effective which can be applied in quantitative determination of nucleosides in Shenfu injection by HPLC.

Shenfu injection；nucleosides；LC-MS；HPLC

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1411-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.006

2014-04-20）

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“十二五”第三批課題（2013ZX09201018）

△通信作者