李文瑞，葉敏南，彭 琪，龍健靈，何月敬，程慶秋，曾小媚，陸小梅＊

（1.東莞市兒科研究所，廣東東莞523320；2.廣東醫(yī)學院附屬石龍博愛醫(yī)院檢驗科，廣東東莞523320）

東莞地區(qū)G6PD缺乏癥的分子流行病學研究

李文瑞1，葉敏南2，彭 琪1，龍健靈1，何月敬1，程慶秋1，曾小媚1，陸小梅1＊

（1.東莞市兒科研究所，廣東東莞523320；2.廣東醫(yī)學院附屬石龍博愛醫(yī)院檢驗科，廣東東莞523320）

目的 了解東莞地區(qū)人群G6PD缺乏的流行特征，為本地區(qū)提供G6PD缺乏癥基因突變、基因型及表型資料，完善本地區(qū)基因突變譜，并為制訂本地區(qū)G6PD缺乏癥的預防計劃提供有價值的參考。方法 收集2010年1月至2012年12月在我院進行體檢的男性外周血樣本，采用G6PD／6PGD比值法進行篩查，記錄其G6PD／6PGD比值法檢測結(jié)果，G6PD／6PGD＜l.5確診為G6PD缺乏，陽性樣本采用PCR－RDB進行基因診斷，同時隨機抽取50例陰性樣本作為對照組進行基因診斷。計算疾病檢出率、基因突變、基因型頻率和基因構(gòu)成比。結(jié)果 3885例樣本中共檢出302例表型陽性的G6PD缺乏癥患者，檢出10種基因突變和1種多態(tài)性位點，鑒定出12種基因型，另有3例樣品未發(fā)現(xiàn)PCR－RDB檢測的17種突變類型。50例陰性樣本進行基因診斷均為陰性。東莞市男性人群G6PD缺乏表型陽性的群體檢出率是7.77%，17種常見突變基因攜帶率是7.70%，各種突變類型的構(gòu)成比依次為G1376T（32.8%）、G1388A（34.1%）、A95G（12.4%）、G871A（3.7%）、G392T（3.7%）、C1024T（3.3%）。結(jié)論 本研究闡述了東莞地區(qū)G6PD缺乏的人群發(fā)生率和詳細的基因突變譜和突變頻率，研究資料為在該地區(qū)制訂有效可行的G6PD缺乏預防計劃提供有價值的參考。

G6PD缺乏；G6PD／6PG比值法；基因類型；分子流行病學

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1168）

遺傳性葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（glucose－6－phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥是世界范圍內(nèi)最常見的一種遺傳性人類酶缺乏病，俗稱蠶豆病。G6PD缺乏癥屬于X連鎖不完全顯性遺傳，缺陷者在人群中分布很廣，全世界約有4億人受累［1－4］。G6PD缺乏癥在中國大陸有明顯的地域分布，呈南高北低的分布特點，主要分布在長江以南各省，以廣東、海南、廣西、云南、貴州、四川等省為高［5］。據(jù)報道廣東地區(qū)人群G6PD缺乏發(fā)生率為3.1%－16.1%。隨著對G6PD分子結(jié)構(gòu)的不斷闡明和研究的不斷深入，用WHO標準化方法鑒定的G6PD生化變異型達400余種，基因突變型達到140余種，在中國人群中相繼發(fā)現(xiàn)了17個突變位點，20種突變基因型（表1）［6］。由于G6PD缺乏癥臨床表現(xiàn)差異很大，表型診斷常常會漏診部分輕型患者，特別是女性雜合子，錯誤診斷和用藥可導致延誤病情甚至造成嚴重后果［7］。而在明確診斷情況下，可以通過避免接觸氧化劑等方法預防發(fā)病，盡早防治重癥的出現(xiàn)。因此通過大規(guī)模人群分子流行病學調(diào)查了解本地區(qū)的分子流行病學資料及其基因構(gòu)成情況，對于G6PD缺乏癥的防治具有重要意義。

表1 中國人群的17種突變位點20種G6PD基因突變型及突變率

本研究通過對2011年1月－2013年12月期間在我院參加體檢的男性人群，進行G6PD表型和基因型篩查，以期闡明人群中G6PD缺乏癥的基因頻率、突變類型及其分布的流行病學資料，為在該地區(qū)制訂有效可行的人群G6PD缺乏癥預防計劃奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2010年1月－2012年12月在我院進行體檢的所有男性的外周血樣本，共計3885例，年齡為1歲－50歲（平均年齡29.8±3.2歲），調(diào)查對象為東莞市戶籍人口，臨床資料包括性別、年齡、籍貫、臨床血液學指標、紅細胞滲透脆性。以G6PD／6PGD＜l.5確診為G6PD缺乏。

1.2 實驗方法

1.2.1 抽樣樣本估計 根據(jù)廣東地區(qū)以往G6PD缺乏癥的分子流行病學調(diào)查結(jié)果，G6PD缺乏癥發(fā)生頻率大約在4.2%［8］，本研究共收集男性體檢樣本3885例，符合抽樣調(diào)查時所需樣本大小的要求。由于G6PD基因位于X染色體上，男性為X單體半合子，可以代表人群基因攜帶率和突變頻率。

1.2.2 比值法檢測G6PD酶活 采用廣州米基科技貿(mào)易發(fā)展有限公司生產(chǎn)的改良葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（G6PD）定量比值法試劑盒對血液樣本進行G6PD酶活性進行檢測。嚴格按照試劑說明書進行操作。記錄其G6PD／6PGD比值法檢測結(jié)果，G6PD／6PGD＜l.5確診為G6PD缺乏，陽性樣本采用PCR－RDB進行基因診斷。

1.2.3 PCR－RDB法檢測G6PD基因型 采用我們課題組建立的PCR－RDB檢測體系對血液樣本進行基因型診斷。該檢測體系是建立在PCR的基礎(chǔ)上，將PCR產(chǎn)物與固定在尼龍膜上的檢測探針發(fā)生特異性的雜交反應，再通過生物素－鏈霉親合素－過氧化物酶－雙氧水－四甲基聯(lián)苯胺的一系列顯色反應，最終通過肉眼就可直接判讀結(jié)果?？赏瑫r檢測樣本中存在的17種基因突變型，該方法檢測特異性高，操作簡便，與金標準測序法比對符合率為100%。

1.2.4 分子診斷策略 我們設(shè)計了基于表型、PCR－RDB的G6PD缺乏癥分子診斷策略，如下所示：

2 結(jié)果

3885例樣品中共檢出302例表型陽性的G6PD缺乏癥患者，檢出10種基因突變和1種多態(tài)性位點，鑒定出12種基因型，另有3例樣品未發(fā)現(xiàn)PCRRDB檢測的17種突變類型。東莞市男性人群G6DP缺乏表型陽性的群體檢出率是7.77%，17種突變基因攜帶率是7.70%，常見六種突變類型的構(gòu)成比依次為G1376T（32.8%）、G1388A（34.1%）、A95G（12.4%）、G871A（3.7%）、G392T（3.7%）、C1024T（3.3%）?；蛐皖l率、基因突變頻率及其構(gòu)成比情況見表2。

表2 東莞地區(qū)299例G6PD基因型頻率及構(gòu)成比

3 討論

在發(fā)達國家，大約有1／3的兒科就診患者是由于遺傳疾病，而且遺傳病導致兒童死亡率高［9］。盡管人類基因組計劃和相關(guān)的進展為一些重型的遺傳疾病的治療提供了可能，但目前的方法還是預防。獲得人群中致病基因的攜帶率以及當?shù)厝巳喝后w發(fā)生率是進行診斷防治的前提和基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示東莞市G6PD缺乏表型陽性的男性群體檢出率是7.77%，基因檢出率是99.0%，常見6種突變類型的構(gòu)成比依次為G1376T（32.8%）、G1388A（34.1%）、A95G（12.4%）、G871A（3.7%）、G392T（3.7%）、C1024T（3.3%），與國內(nèi)報道基本一致［10］。本次研究檢出中國地區(qū)少見突變T517C一例、C592T、C1360T各兩例，這些突變在中國地區(qū)較少報道［11］，說明東莞地區(qū)作為中國南方城市具有中國人群G6PD基因突變普遍代表性，又有本地區(qū)的異質(zhì)性。本文在3885條染色體中共檢出10種突變基因和l種多態(tài)性位點，全部為置換型突變。在大樣本調(diào)查基礎(chǔ)上，表型陽性的樣本被確診的情況下，未檢出這17種常見突變的樣本僅3例，占1.0%（3／302），提示在G6DP的分子流行病學調(diào)查中，應用PCR－RDB基因分析所獲得的分子流行病學的資料較為可信和全面。對這3例樣本進行全部編碼外顯子的測序，將可能發(fā)現(xiàn)一些稀有突變和新突變，完善該地區(qū)的疾病突變譜，該工作正在進行之中。本文獲得的東莞市人群中的G6PD基因突變、基因頻率和構(gòu)成比的資料可為制訂該地區(qū)G6DP缺乏癥的預防計劃提供有價值的參考。東莞市人口近822萬，按16／1000的人口出生率計算，根據(jù)本文的調(diào)查結(jié)果，理論上每年出生的G6PD缺乏癥患者約131520人，而男嬰和部分女嬰將出現(xiàn)臨床癥狀，考慮到廣東更大的人口基數(shù)，該地區(qū)有很大的由于G6PD缺乏患兒出生造成的人口質(zhì)量壓力，這是值得重視的人口出生缺陷課題。我國南方地區(qū)已經(jīng)將G6PD篩查作為新生兒篩查的常規(guī)項目，將對于疾病的預防和診治提供極大幫助。本研究結(jié)果顯示東莞地區(qū)人群G6PD缺乏發(fā)病率高達7.77%，若能采取婚檢和新生兒篩查可有效的早期診斷并預防發(fā)病，并對高風險夫婦提供相應的遺傳咨詢，對于疾病的防治具有重要意義。

［1］Beutler E.G6PD：population genetics and clinical manifestations［J］.Blood Rev，1996，10：45.

［2］Miwa S，F(xiàn)ujii H.Molecular basis of erythroenzymopathies associated with hereditary hemolytic anemia：tabulation of mutant enzymes［J］.Am J Hematol，1996，51：122.

［3］GR S，BE S.Sickle Cell Disease［M］.Volume 3rd edition.Oxford University Press，2001.

［4］Frank JE.Diagnosis and Management of G6PD Deficiency［J］.Am Fam Physician 2005，72（7）：1277.

［5］徐 蕓，羅建明.我國G6PD缺乏癥基因突變的研究現(xiàn)狀［J］.中國小兒血液與腫瘤雜志，2009，1（3）：143.

［6］杜傳書.我國葡萄糖－6－磷酸脫氫酶缺乏癥研究40年的回顧和展望［J］.中華血液學雜志，2000，21（4）：174.

［7］Yan JB，Xu HP，Xiong C，et al.Rapid and reliable detection of glucose－6－phosphate dehydrogenase（G6PD）gene mutations in Han Chinese using high－resolution melting analysis［J］.J Mol Diagn，2010，12：305.

［8］Du CS，Xu YK，Hua XY，et al.Glucose－6－phosphate dehydrogenase variants and their frequency in Guangdong，China［J］.Hum－Genet.1988，80：385.

［9］潘尚領(lǐng).東亞及東南亞地區(qū)G6PD缺陷的地域分布以及瘧疾的正選擇作用［J］.中國優(yōu)生優(yōu)育現(xiàn)代人類學通訊，2007，13（S）：42.

［10］Xiaomei Lu，Liang Hua，Ting Zhang et al.A reverse dot blot assay for the expanged screening of eleven Chinese G6PD mutations［J］.Clinica Chimica Acta，2013，48：45.

［11］Minucci A，Moradkhani K，Zuppi C et al.Glucose－6－phosphate dehydrogenase（G6PD）mutations database：review of the“old”and update of the new mutations［J］.Blood Cells Mol Dis，2012，48：154.

Molecular Epidemiological Analysis of G6PD Deficiency in Dongguan Area

LI Wen－rui，YE Min－nan2，PENG Qi1，et al.
（1.Dongguan Institute of Pediatrics，Dongguan523320，China；2.Department of Laboratory，Affiliated Shilong Boai Hospital of Guangdong Medical College，Dongguan523320，China）

Objective To explore the epidemiological characteristics of population with G6PD deficiency in Dongguan area，and provide data of G6PD deficiency gene mutations，genotype and phenotype information of local area，perfect the gene mutation spectrum in this region，and provide valuable reference for formulate G6DP deficiency prevention programs.Methods The peripheral blood samples of male who took physical examination in our hospital from January 2010to December 2012were collected.We measured their G6PD activity，recorded the testing results of G6PD／6PGD ratio，take G6PD／6PGD＜l.5as G6PD deficiency，then positive one was detected the mutations by reverse dot blot（RDB）assay.Calculate its disease detection，gene mutation，gene frequency and constituent ratio.Results 302out of 3885cases were phenotype positive，there are 10gene mutations，1polymorphism loci and 12genotypes，other 3cases were normal with the 17types of mutations.The positive rate of G6PD deficiency phenotypic in Dongguan male was 7.77%，the proportion of 17common mutations was 7.70%，the proportion of most common types of mutations were G1376T（32.8%）、G1388A（34.1%）、A95G（12.4%）、G871A（3.7%）、G392T（3.7%）、C1024T（3.3%）.Conclusion Our study analyzed the incidence rate，gene mutation frequency of G6DP deficiency in Dongguan area，and provide valuable reference for making G6PD deficiency prevention programs.

G6PD deficiency；G6PD／6PG ratio；genotype；molecular epidemiology

Q78

A

2013－08－14）

1007－4287（2014）07－1168－04

東莞市科技計劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研重點項目（NO.2011105102017）

＊通訊作者