馬峰，周倩，李夢潔，朱文麗，*，王娜，張葳芮

（1.北京航天中心醫(yī)院呼吸科，北京100049；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京100191；3.天津市天獅生命科學(xué)與技術(shù)研究院，天津 301700）

營養(yǎng)高鈣沖劑和營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）均以鮮牛脊椎骨為原料，是經(jīng)過不同的加工工藝生產(chǎn)的補鈣新產(chǎn)品。本實驗選取這兩種鈣劑為受試物，以碳酸鈣為對照，旨在研究并比較這兩種鈣劑對大鼠骨密度和鈣吸收率的影響，進而比較不同加工工藝的優(yōu)劣，為更合理利用畜骨資源提供依據(jù)，同時也為居民合理選擇補鈣制品提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 受試物

營養(yǎng)高鈣沖劑、營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉），鈣含量分別為6.05%和5.71%，由天津天獅生物工程有限公司提供。作為對照的碳酸鈣購自西隴化工股份有限公司，鈣含量為39.6%。

1.2 實驗動物

SPF級健康4周齡斷乳SD大鼠，雌性，96只，體重60 g～75 g。由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2006－0008，實驗動物使用許可證：SYXK（京）2007－0008。飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級，實驗環(huán)境溫度23℃～24℃，濕度54%～58%。

1.3 動物飼料

動物基礎(chǔ)飼料配方為：10.0%酪蛋白，15.0%黃豆粉，54.0%小麥面粉，4.0%玉米油或花生油，2.0%纖維素，2.6%混合礦物鹽，1%混合維生素，0.2%氯化膽堿，0.2%DL－蛋氨酸，11.0%淀粉。調(diào)整鈣含量為150 mg/100 g飼料。用此低鈣飼料配方配制受試物各劑量組和碳酸鈣對照組，可根據(jù)各組受試物（或碳酸鈣）的需用量調(diào)節(jié)淀粉用量。動物飼料由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006－0003。

1.4 主要儀器設(shè)備

雙能X線吸收骨密度儀（DEXA，HOLOGIC Discovery A（S/N 86171））；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP－OES，iCAP－6000）。

1.5 方法

1.5.1 動物分組及劑量設(shè)置

動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，稱體重，按體重隨機分為10組，每組8只～10只。

兩種受試物均設(shè)3個劑量組，分別以人體推薦攝入量（元素鈣800 mg/d，按60公斤體重計，折算為13.3 mg/kg·BW）的 5倍、10倍、30倍設(shè)為低、中、高劑量組 （分別為 66.7 mg/kg·BW、133.3 mg/kg·BW 和400.0 mg/kg·BW）；同時設(shè)一個低鈣對照組（飼料鈣含量為150 mg/100 g）和3個碳酸鈣對照組（其中元素鈣的攝入量分別與受試物低、中、高劑量組相同）。

1.5.2 受試物給予方式

按動物攝食量10%計，根據(jù)受試物和碳酸鈣中的鈣含量計算各組鈣劑需用量，分別將低、中、高劑量受試物和碳酸鈣摻入低鈣飼料中，則低、中、高劑量組飼料鈣含量分別為 216.7 mg/100 g、283.3 mg/100 g和550.0 mg/100 g。所有組別實驗動物均自由攝食，飲用去離子水，以避免從飲水中獲得鈣。飼養(yǎng)13周。

1.5.3 觀察指標

1.5.3.1 體重、身長

每周測量1次。

1.5.3.2 攝食量測定

記錄每只動物的一周總攝食量，計算食物利用率。

食物利用率（%）= 動物體重增加（g）/飼料攝入（g）×100%

1.5.3.3 代謝實驗

實驗3周后將動物放在代謝籠中進行3天鈣代謝實驗。記錄3天進食量，收集72 h糞便，測定飼料、糞便中鈣含量（等離子體發(fā)射光譜法）。飼料研磨后測定平行樣，取平均值。

攝入鈣（mg/3d）= 飼料中鈣含量（mg/g）×進食量（g/3d）糞鈣（mg/3d）= 糞便中鈣含量（mg/g）×糞便排出量（g/3d）鈣表現(xiàn)吸收率（%）=（攝入鈣－糞鈣）/攝入鈣×100%

1.5.3.4 骨恒重和骨鈣測定

動物飼養(yǎng)13周后，處死，剝離左、右側(cè)股骨，剔除干凈骨周圍附著軟組織。取大鼠右側(cè)股骨在105℃烘箱中烘干至恒重后（間隔1小時稱量差值不超過0.000 3 g），稱量骨干重。等離子體發(fā)射光譜法測定右側(cè)股骨鈣含量。

1.5.3.5 骨長和骨密度測定

測量左側(cè)股骨全長；以雙能X線吸收骨密度儀（DEXA）測定股骨中點、遠心端和近心端骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件進行各受試物組與低鈣對照組及相應(yīng)劑量碳酸鈣對照組的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 受試物對大鼠體重、身長和總食物利用率的影響

受試物對大鼠體重、身長、總食物利用率的影響結(jié)果見表1。

表1 受試物對大鼠體重、身長、總食物利用率的影響Table 1 Effect of different test substances on body weight，body length and total food utilization in rats（±SD）

表1 受試物對大鼠體重、身長、總食物利用率的影響Table 1 Effect of different test substances on body weight，body length and total food utilization in rats（±SD）

注：*與低鈣對照組相比，P＜0.05；△與相同劑量碳酸鈣對照組相比，P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 體重/g 身長/cm 總食物利用率/%0周 第13周末 0周 第13周末營養(yǎng)高鈣沖劑低劑量組 9 67.0±9.3 374.4±45.6 23.82±1.79 42.74±1.44△ 20.6±1.4中劑量組 10 66.8±9.3 366.0±50.6 23.83±1.10 43.20±1.32*△ 20.7±1.5高劑量組 10 67.5±9.0 379.4±43.3* 23.32±1.75 42.08±1.21 19.7±1.1△營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）低劑量組 10 66.2±8.4 351.9±44.3 23.02±1.19 41.34±1.29 19.9±1.4中劑量組 10 65.5±8.1 352.7±31.3 22.89±1.22 41.27±1.13 20.3±1.1高劑量組 10 65.5±7.8 358.8±26.1△ 23.21±1.44 41.88±1.39 19.8±1.3△碳酸鈣低劑量組 9 66.9±6.9 353.9±34.6 23.40±1.16 41.10±1.08 20.5±1.1中劑量組 8 67.0±7.1 344.6±40.8 23.94±1.25 41.88±1.30 20.4±0.9高劑量組 10 64.5±6.1 396.8±40.3* 22.93±1.18 42.63±1.61 21.7±1.1*低鈣對照組 10 65.6±7.7 338.4±35.3 23.14±1.12 41.83±0.83 20.0±1.3

試驗初始各劑量組動物體重、身長無明顯差異。喂養(yǎng)期間，實驗動物未出現(xiàn)明顯疾病和死亡。

試驗結(jié)束時（13周末），“超細骨粉”高劑量組體重低于碳酸鈣組（P＜0.05），其余各組與碳酸鈣組相比差異無顯著性（P＞0.05）。兩種受試物相應(yīng)劑量組之間體重?zé)o明顯差異（P＞0.05）。13周末時，營養(yǎng)高鈣沖劑低、中劑量組身長大于相應(yīng)碳酸鈣組（P＜0.05），其余各組與碳酸鈣組相比無明顯差異（P＞0.05）。營養(yǎng)高鈣沖劑低、中劑量組身長大于“超細骨粉”組，且均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。營養(yǎng)高鈣沖劑和“超細骨粉”高劑量組總食物利用率低于碳酸鈣組（P＜0.05），其余各組與碳酸鈣組相比差異無顯著性（P＞0.05）。兩種受試物相互比較差異亦無顯著性（P＞0.05）。

2.2 受試物對大鼠鈣表觀吸收率的影響

受試物對大鼠鈣表觀吸收率的影響結(jié)果見表2。與低鈣對照組比較，營養(yǎng)高鈣沖劑中劑量組及“超細骨粉”低、中劑量組的鈣吸收率明顯較高（P＜0.05），而營養(yǎng)高鈣沖劑高劑量組明顯較低（P＜0.05）；與相應(yīng)劑量碳酸鈣組相比，營養(yǎng)高鈣沖劑中劑量組吸收率明顯較低（P＜0.05），其余組別無明顯差異。受試物相互比較結(jié)果顯示，“超細骨粉”低劑量組鈣表觀吸收率高于營養(yǎng)高鈣沖劑低劑量組（P＜0.05）。

表2 受試物對大鼠鈣表觀吸收率的影響Table 2 Effect of different test substances on calcium apparent absorption rate in rats（±SD）

表2 受試物對大鼠鈣表觀吸收率的影響Table 2 Effect of different test substances on calcium apparent absorption rate in rats（±SD）

注：*與低鈣對照組相比，P＜0.05；△與相同劑量碳酸鈣對照組相比，P＜0.05。

數(shù)/只 攝入鈣/mg 糞鈣/mg 鈣表觀吸收率/%營養(yǎng)高鈣沖劑低劑量組 9 59.79±7.30* 6.19±1.10 89.67±1.13中劑量組 10 76.44±10.78* 7.25±1.37* 90.53±1.09*△高劑量組 10 185.77±22.68*△ 34.57±6.59* 81.51±1.65*營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）低劑量組 10 56.37±4.40* 4.31±1.13 92.42±1.55*中劑量組 10 77.57±7.50* 5.90±1.02 92.37±1.20*高劑量組 10 184.51±21.45*△ 28.87±7.24* 84.41±3.20碳酸鈣低劑量組 9 64.68±9.16* 5.69±1.06 91.19±1.37*中劑量組 8 81.88±14.75* 5.57±1.08 93.19±0.60*高劑量組 10 230.05±20.84* 62.52±29.62* 73.47±10.16低鈣對照組 10 34.27±2.71 4.28±0.35 87.44±1.47組別 動物

2.3 受試物對大鼠股骨鈣含量和骨恒重的影響

受試物對大鼠股骨鈣含量和骨恒重的影響結(jié)果見表3。各受試物組右側(cè)股骨鈣含量和骨恒重均明顯高于低鈣對照組（P＜0.05）；而與相應(yīng)劑量碳酸鈣組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩種受試物之間骨鈣含量和骨恒重比較，差異亦無顯著性（P＞0.05）。

表3 受試物對大鼠股骨鈣含量和骨恒重的影響Table 3 Effect of different test substances on bone calcium content and bone constant weight in rats（±SD）

表3 受試物對大鼠股骨鈣含量和骨恒重的影響Table 3 Effect of different test substances on bone calcium content and bone constant weight in rats（±SD）

注：*與低鈣對照組相比，P＜0.05；△與相同劑量碳酸鈣對照組相比，P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 骨鈣含量/mg/g 骨恒重/mg營養(yǎng)高鈣沖劑低劑量組 9 214.48±9.19* 480.92±38.92*中劑量組 10 222.89±11.77* 514.52±43.27*高劑量組 10 242.92± 5.24* 590.58±47.93*營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）低劑量組 10 212.10±15.10* 476.75±46.32*中劑量組 10 228.64±22.46* 522.55±37.14*高劑量組 10 238.50±14.81* 577.60±29.85*碳酸鈣低劑量組 9 202.58±22.48 498.33±41.23*中劑量組 8 219.90±7.54* 512.26±25.47*高劑量組 10 236.98±7.32* 604.96±53.47*低鈣對照組 10 175.87±14.77 387.68±22.81

2.4 受試物對大鼠股骨骨密度和骨長的影響

由于手術(shù)操作中股骨剝離不完整、缺損等問題，骨密度和骨長測定動物只數(shù)少于入組動物數(shù)。

受試物對大鼠股骨密度和骨長的影響結(jié)果見表4。兩種受試物各劑量組大鼠左側(cè)股骨近心端、中點和遠心端骨密度均明顯高于低鈣對照組（P＜0.05）。與碳酸鈣對照組相比，營養(yǎng)高鈣沖劑低、中劑量組和“超細骨粉”低劑量組股骨中點骨密度、營養(yǎng)高鈣沖劑低劑量組近心端骨密度明顯較低（P＜0.05），其余組別無明顯差異（P＞0.05）。受試物相應(yīng)組別之間比較顯示，“超細骨粉”中劑量組近心端骨密度明顯高于營養(yǎng)高鈣沖劑組（P＜0.05），其余組別差異無顯著性（P＞0.05）。

除營養(yǎng)高鈣沖劑高劑量組左側(cè)股骨長大于低鈣對照組（P＜0.05）外，其余各組與低鈣對照組和相應(yīng)的碳酸鈣組相比無明顯差異（P＞0.05）。受試物相應(yīng)組別之間骨長相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 受試物對大鼠股骨密度和骨長的影響Table 4 Effect of different test substances on femur bone mineral density and bone length in rats（±SD）

表4 受試物對大鼠股骨密度和骨長的影響Table 4 Effect of different test substances on femur bone mineral density and bone length in rats（±SD）

注：*與低鈣對照組相比，P＜0.05；△與相同劑量碳酸鈣對照組相比，P＜0.05。

組別動物數(shù)/只股骨近心端BMD/（g/cm2）股骨中點BMD/（g/cm2）股骨遠心端BMD/（g/cm2）股骨長/mm營養(yǎng)高鈣沖劑低劑量組 9 0.197 3±0.018 6*△ 0.192 3±0.013 8*△ 0.251 3±0.029 8* 35.93±0.76中劑量組 10 0.214 1±0.017 9* 0.216 0±0.009 5*△ 0.275 9±0.014 8* 35.94±0.66高劑量組 10 0.247 5±0.014 5* 0.261 3±0.011 2* 0.330 1±0.018 0* 36.57±0.81*營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）低劑量組 10 0.203 9±0.011 1* 0.186 4±0.021 7*△ 0.238 3±0.017 6* 36.30±1.24中劑量組 10 0.232 1±0.014 1* 0.227 6±0.021 0* 0.304 7±0.020 3* 35.99±0.88高劑量組 9 0.244 6±0.011 9* 0.259 5±0.012 3* 0.335 5±0.018 7* 36.38±0.49碳酸鈣低劑量組 8 0.216 4±0.011 2* 0.217 6±0.013 8* 0.265 5±0.017 8* 35.77±0.92中劑量組 8 0.226 9±0.010 4* 0.231 1±0.020 7* 0.304 2±0.014 6* 35.96±0.60高劑量組 10 0.246 5±0.018 5* 0.270 9±0.016 0* 0.353 3±0.019 6* 36.60±0.81*低鈣對照組 10 0.175 9±0.014 7 0.140 4±0.020 2 0.185 8±0.01 62 35.67±0.73

3 討論

本試驗結(jié)果表明，營養(yǎng)高鈣沖劑中劑量組鈣吸收率低于碳酸鈣組（P＜0.05）；股骨鈣含量明顯高于低鈣對照組，與碳酸鈣組相比差異無顯著性（P＞0.05）；股骨骨密度高于低鈣對照組，低、中劑量組股骨中點骨密度和低劑量組近心端骨密度低于相應(yīng)碳酸鈣組（P＜0.05）。依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003）[1]，不能判定營養(yǎng)高鈣沖劑具有增加骨密度的作用。營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）組鈣吸收率與碳酸鈣組相比無明顯差異（P＞0.05）；股骨鈣含量高于低鈣對照組，與碳酸鈣組相比差異無顯著性（P＞0.05）；股骨骨密度高于低鈣對照組，其中低劑量組股骨中點骨密度低于相應(yīng)碳酸鈣組（P＜0.05）。依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003），可以判定營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）具有增加骨密度的作用。兩種受試物相互比較顯示，營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）低劑量組鈣吸收率高于營養(yǎng)高鈣沖劑組（P＜0.05）；營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）中劑量組近心端骨密度高于營養(yǎng)高鈣沖劑組（P＜0.05）。該結(jié)果提示營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）在增加骨密度功能方面優(yōu)于營養(yǎng)高鈣沖劑。

營養(yǎng)高鈣沖劑和營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）的主要成分均為酶解骨鈣粉，是以新鮮的牛脊椎骨為原料，采用生物酶解技術(shù)分解骨粉中殘留的蛋白質(zhì)，使骨鈣充分分離出來，并生成可溶性的氨基酸鈣和肽螯合鈣，從而促進鈣的吸收利用[2－5]。營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）在營養(yǎng)高鈣沖劑的基礎(chǔ)上應(yīng)用了超微粉碎的加工工藝，使骨粉顆粒細化。超微粉碎技術(shù)是利用各種特殊的粉碎設(shè)備，對物料進行碾磨、沖擊、剪切等，將粒徑在3 mm以上的物料粉碎至粒徑為10 μm～25 μm以下的微細顆粒的過程[6]。超微粉碎技術(shù)可使顆粒粒徑變小，相應(yīng)的比表面積增大，從而使顆粒具有高溶解性、高吸附性、高流動性等多方面的活性[7－9]。1997年美國政府審查機構(gòu)通過大量嚴格的實驗指出，平均直徑在110 μm以下的骨粒，在與人體胃液相同的pH下是可溶的，骨粉的微?；欣诠欠垲w粒進入人體后與消化液作用[5]。而鈣的被動吸收過程是一種由高濃度向低濃度的擴散過程，任何能使鈣溶解增加和保持其溶解的因素均可促進被動彌散[10]。因此，骨粉的超細化可通過增加鈣溶解而促進鈣的被動吸收過程。目前，更多的研究開始關(guān)注超細鮮骨粉。袁玉燕等[11]的研究通過對超細鮮骨粉和高溫高壓蒸煮后的骨粉進行顯微結(jié)構(gòu)比較和營養(yǎng)成分測試，認為超細鮮骨粉顆粒更細，更利于人體吸收。李慶天、蔡鳳嗚等的實驗研究說明超細鮮骨粉與活性鈣對機體均有明顯的補鈣作用，且吸收率較高，而機體在一般缺鈣期對超細鮮骨粉制品的鈣吸收率明顯高于活性鈣制品[12]。超細鮮骨粉也因具有較好的鈣生物學(xué)功能而廣泛應(yīng)用到強化食品中[13－15]。本試驗結(jié)果也顯示，營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）在增加鈣吸收率和增加骨密度方面優(yōu)于營養(yǎng)高鈣沖劑。這與本實驗室前期關(guān)于酶解骨鈣粉細粉與普通酶解骨鈣粉的研究結(jié)果是一致的，均提示超細化的加工工藝可以提高鈣的吸收利用。

國家標準（GB 14924.3－2010實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分）規(guī)定大鼠配合飼料中鈣含量為1.0%～1.8%，本試驗中高劑量組飼料鈣含量（0.55%）也只達到大鼠飼料推薦攝入量下限（1.0%）的55%，未能完全滿足大鼠需要。機體處于鈣缺乏狀態(tài)時會通過增加鈣吸收率進行自我調(diào)節(jié)，這也是本試驗受試物組鈣吸收率均超過80%且低、中劑量組鈣吸收率高于高劑量組的主要原因。相比而言，高劑量組飼料鈣含量更接近動物的生理需要量。若只與碳酸鈣高劑量組相比，兩種受試物的鈣吸收率、骨鈣含量和骨密度均無明顯差異（P＞0.05）。依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003），可以判定兩種受試物均具有增加骨密度的作用。

綜上所述，營養(yǎng)高鈣沖劑（超細骨粉）增加骨密度的功能優(yōu)于營養(yǎng)高鈣沖劑，可以作為一種較好的鈣劑選擇。對骨粉進行超細化的加工工藝可以提高鈣的吸收利用。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2003]42號保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)[S].北京:中華人民共和國衛(wèi)生部,2003

[2] JUNG WK,KIM SK.Calcium－binding peptide derived from pepsinolytic hydrolysates of hoki（Johnius belengerii）frame[J].Eur Food Res Technol,2007(224):763－767

[3] HUANG G,REN L,JIANG J.Purification of a histidine－containing peptide with calcium binding activity from shrimp processing byproducts hydrolysate[J].Eur Food Res Technol,2011,232(2):281－287

[4] 許雄,孫靈霞,李苗云,等.酶解畜禽骨肉的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(9):3677－3679

[5] 宋俊梅,曲靜然.促進骨鈣生物可利用性的研究[J].食品科技,2002(2):60－62

[6]高福成.現(xiàn)代食品工業(yè)高新技術(shù) [M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1997:21－56

[7] 張霞,李琳,李冰.功能食品的超微粉碎技術(shù)[J].食品工業(yè)科技,2010,31(11):375－378

[8] 陳文華,成曉瑜,馮平,等.鮮骨超細粉碎技術(shù)研究[J].肉類研究,2007(10):20－21,34

[9] 張潔,于穎,徐桂花.超微粉碎技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究,2010,31(1):51－54

[10]孫曉紅.大腸在鈣吸收中的作用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2002,29(6):796－797

[11]袁玉燕,韓愛軍,李鳳生.超細鮮骨粉的粒度及營養(yǎng)特性[J].食品工業(yè),2001(3):10－12

[12]葉明泉,鄧國棟,韓愛軍,等.超細鮮骨粉的制備及其營養(yǎng)功能研究[J].南京理工大學(xué)學(xué)報,1999,23(1):6－9

[13]陳麗堯,李曉東,王銳.具有補鈣功能的超微粉碎骨泥火腿腸的研究[J].食品工業(yè)科技,2008(5):191－192,195

[14]花金東,徐幸蓮,周光宏,等.超細鮮骨粉在西式腸類制品中的應(yīng)用[J].肉類研究,2002(2):35－36,44

[15]黃紅衛(wèi),邱燕翔.超細粉碎酶解鮮骨粉功能性調(diào)味料的研究[J].食品科技,2005(9):91－93