張治平，司軍強(qiáng)，李新芝，李麗，魏麗麗，馬克濤

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.生理學(xué)教研室;2.病理生理學(xué)教研室，石河子 832000)

·藥物研究·

奎寧和甘珀酸對豚鼠腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道的影響*

張治平1，司軍強(qiáng)1，李新芝2，李麗1，魏麗麗1，馬克濤1

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.生理學(xué)教研室;2.病理生理學(xué)教研室，石河子 832000)

目的 觀察奎寧和甘珀酸對腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道的影響,為探索強(qiáng)效縫隙連接阻斷藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)探討奎寧和甘珀酸對豚鼠腸系膜動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電容、細(xì)胞膜電導(dǎo)或細(xì)胞膜電阻的影響。結(jié)果腸系膜動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電容和細(xì)胞膜電導(dǎo)大約是消化的單個(gè)細(xì)胞的10倍,提示細(xì)胞間存在豐富的縫隙連接通道。奎寧和甘珀酸能夠濃度依賴地減少腸系膜動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電容和膜電導(dǎo),抑制細(xì)胞膜電導(dǎo)的半數(shù)抑制濃度分別為1.56和0.13 mmol·L-1,當(dāng)奎寧≥3 mmol·L-1或者甘珀酸≥0.3 mmol·L-1時(shí),腸系膜動脈段上平滑肌細(xì)胞的膜電容、膜電導(dǎo)或膜電阻與單個(gè)細(xì)胞的數(shù)值十分接近。提示奎寧和甘珀酸能夠完全阻斷細(xì)胞間縫隙連接通訊。結(jié)論奎寧和甘珀酸能夠濃度依賴地阻斷腸系膜動脈細(xì)胞間縫隙連接通道,甘珀酸的抑制效力更強(qiáng)。

奎寧；甘珀酸；腸系膜動脈；縫隙連接；膜片鉗

縫隙連接廣泛存在于多種組織和器官,是細(xì)胞間電化學(xué)信息傳遞直接通路[1-2]。縫隙連接的基本構(gòu)成單位是連接子,由6個(gè)不同或相同的連接蛋白(connexin,Cx)亞單位環(huán)繞,形成一個(gè)中心約1.5 nm的孔道,相鄰細(xì)胞膜上的兩個(gè)連接子對接便形成一個(gè)縫隙連接通道?？p隙連接可以允許相對分子質(zhì)量＜1 000的分子通過。目前發(fā)現(xiàn)超過20種連接蛋白表達(dá)在不同的組織和器官[1,3],其中在血管微動脈主要表達(dá)Cx37、Cx40、Cx43和Cx45[4]?？p隙連接在維持生理功能中發(fā)揮著重要作用,尤其在血管舒縮運(yùn)動的調(diào)節(jié)中更為突出[4-8]。血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞同步化以及血管舒縮信號在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間傳遞都依賴細(xì)胞間縫隙連接的完整性[5,9]。為了研究縫隙連接在生理和病理生理狀態(tài)下所扮演的角色,需要有特異性縫隙連接阻斷藥。前期研究發(fā)現(xiàn),奎寧和甘珀酸分別可以阻斷培養(yǎng)的神經(jīng)瘤母細(xì)胞和人突變成纖維細(xì)胞間的縫隙連接[10-12],但在急性分離的血管微動脈標(biāo)本上尚無類似研究。本實(shí)驗(yàn)在豚鼠急性分離的腸系膜動脈(mesenteric artery,MA)上應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),觀察奎寧和甘珀酸對血管微動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)豚鼠,雌雄不拘,新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供,動物質(zhì)量符合一級標(biāo)準(zhǔn),體質(zhì)量200～300 g,麻醉狀況下處死后取出腸系膜并置于生理鹽溶液中。生理鹽溶液包括:氯化鈉(NaCl) 138 mmol·L-1,氯化鉀(KCl)5 mmol·L-1,氯化鈣(CaCl2)1.6 mmol·L-1,氯化鎂(MgCl2)1.2 mmol·L-1, 4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerthyl)piperazine-1-erhaesulfonic acid,Na-HEPES]5 mmol·L-1,N-(2-羥乙基哌嗪-N′-(Z-乙磺酸)鈉鹽[N-2(hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonicacid,sodiumsalt,HEPES] 6 mmol·L-1,葡萄糖7.5 mmol·L-1。在生理鹽溶液中,迅速取出腸系膜動脈及其分支。

動脈段標(biāo)本的制備:動脈段標(biāo)本直徑約100 μm,長約0.4 mm,兩端用細(xì)鉑金片固定在培養(yǎng)皿底部,在37℃溫箱中用含1.5 mg·mL-1膠原酶A的生理鹽溶液消化15 min,然后用不含膠原酶的生理鹽溶液置換2次,體顯微鑷下去除結(jié)締組織后進(jìn)行微動脈段全細(xì)胞膜片鉗。

單個(gè)平滑肌細(xì)胞的制備:微動脈置于細(xì)胞分離液中20 min,細(xì)胞分離液包括:NaCl 142 mmol·L-1,KCl 5mmol·L-1,CaCl20.05mmol·L-1,MgCl21 mmol·L-1,Na-HEPES4mmol·L-1,HEPES 5 mmol·L-1,葡萄糖7.5 mmol·L-1。將微動脈剪成幾段放入消化液后,在37℃溫箱中消化20～25 min,消化液包括:木瓜蛋白酶0.75 mg·mL-1,膠原酶IA 1 mg·mL-1,二硫蘇糖醇0.3 mg·mL-1,牛血清清蛋白3.75 mg·mL-1。1 000 r·min-1離心6 min后棄上清液,加入細(xì)胞分離液制成細(xì)胞懸浮液,反復(fù)替換3次后將液體移至用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿內(nèi),靜置30 min使細(xì)胞貼壁后進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄 室溫下進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。記錄電極阻抗約為5 MΩ,由P-97拉制儀拉制。電極內(nèi)液包括:K-gluconate 130mmol·L-1,NaCl 10 mmol·L-1,CaCl22.0mmol·L-1,MgCl21.2 mmol·L-1,HEPES 10 mmol·L-1,乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraaceticacid,EGTA]5 mmol·L-1,葡萄糖7.5 mmol·L-1。通過微操縱器觸及到細(xì)胞膜后給予負(fù)壓形成GΩ封接。補(bǔ)償電極電容后給予瞬時(shí)電刺激或者負(fù)壓擊破細(xì)胞膜,形成全細(xì)胞膜片鉗,膜電流用10 kHz低頻濾過[13]。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 實(shí)驗(yàn)藥物用生理鹽溶液配制,通過開關(guān)控制藥物灌流標(biāo)本,保持灌流速度、溫度和其他成分不變?？鼘幒透淑晁嵊蒘igma公司提供,其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動脈段上平滑肌細(xì)胞間存在縫隙連接 腸系膜動脈段和單個(gè)平滑肌細(xì)胞的膜電容、膜電導(dǎo)和膜電阻見表1。動脈段標(biāo)本上平滑肌細(xì)胞膜電容和膜電導(dǎo)大約是消化分離的單個(gè)平滑肌細(xì)胞的10倍,提示微動脈段標(biāo)本上平滑肌細(xì)胞間存在著縫隙連接通道。

表1 微動脈段上和單個(gè)平滑肌細(xì)胞的膜電生理特性比較Tab.1 Comparison of character of membrane electrophysiology between arteriole and the dispersed smooth muscle cell ±s

表1 微動脈段上和單個(gè)平滑肌細(xì)胞的膜電生理特性比較Tab.1 Comparison of character of membrane electrophysiology between arteriole and the dispersed smooth muscle cell ±s

與動脈段標(biāo)本比較,*1P＜0.01Compared with arteriole samples,*1P＜0.01

膜電生理特性例數(shù)膜電阻/MΩ膜電導(dǎo)/nS膜電容/pF動脈段標(biāo)本12 380±613.17±0.44149.00±23.00單個(gè)平滑肌細(xì)胞16 2 759±293*10.48±0.045*113.20±0.98*1

2.2 奎寧和甘珀酸抑制動脈段上平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接 圖1顯示,0.3 mmol·L-1甘珀酸和3 mmol·L-1奎寧都能夠顯著抑制微動脈段上平滑肌細(xì)胞的膜電導(dǎo)和膜電容。甘珀酸使細(xì)胞膜電導(dǎo)分別從2.43 nS降至0.20 nS,膜電容從97 pF降至12.6 pF;奎寧使細(xì)胞膜電導(dǎo)分別從4.68 nS降至0.45 nS,膜電容從132 pF降至14.3 pF。應(yīng)用單指數(shù)方程分別對施加奎寧和甘珀酸前后擬合發(fā)現(xiàn),未應(yīng)用奎寧和甘珀酸前擬合效果較差(r≤0.90),應(yīng)用奎寧和甘珀酸后擬合效果很好(r＞0.98),且細(xì)胞膜充放電的時(shí)間常數(shù)也顯著降低。表2總結(jié)了應(yīng)用甘珀酸和奎寧對細(xì)胞膜電容、膜電阻和膜電導(dǎo)的影響,結(jié)果顯示應(yīng)用0.3 mmol·L-1甘珀酸和3 mmol·L-1奎寧后上述電生理參數(shù)與表1中單個(gè)平滑肌細(xì)胞的數(shù)值十分接近,提示甘珀酸和奎寧可以完全阻斷細(xì)胞間的縫隙連接。

此外,給予Ramp電壓刺激發(fā)現(xiàn)奎寧和甘珀酸凈電流I/V曲線為線性,且凈電流翻轉(zhuǎn)電位與細(xì)胞靜息電位十分接近(圖2)。提示奎寧和甘珀酸主要抑制細(xì)胞間的縫隙連接,減少細(xì)胞的膜電導(dǎo)。

圖1 甘珀酸(A)和奎寧(B)對微動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接的抑制作用Fig.1 Inhibition of carbenoxolone(A)and quinine(B)on gap junction channel of arterial smooth muscle cells

表2 奎寧和甘珀酸對動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電生理特性的影響Tab.2 Effect of quinine and carbenoxolone on electrophysiological characteristics of arterial smooth muscle cells ±s

表2 奎寧和甘珀酸對動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電生理特性的影響Tab.2 Effect of quinine and carbenoxolone on electrophysiological characteristics of arterial smooth muscle cells ±s

與奎寧對照組比較,*1P＜0.01Compared with quinine control group,*1P＜0.01

藥物與分組例數(shù)膜電阻/MΩ膜電導(dǎo)/nS膜電容/pF奎寧對照組6452.00±90.002.79±0.62120.00±11.00處理組62 322.00±551.00*10.58±0.17*115.80±0.69*1甘珀酸對照組6383.00±52.003.74±0.55179.00±44.00處理組62 062.00±622.00*10.60±0.19*117.30±0.93

2.3 奎寧和甘珀酸濃度依賴抑制腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道 奎寧和甘珀酸對微動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道的抑制具有濃度依賴性(圖3), 0.01～3 mmol·L-1奎寧和甘珀酸可以濃度依賴地降低腸系膜動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電導(dǎo)?？鼘幒透淑晁嵋种颇c系膜動脈微動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電導(dǎo)的半數(shù)抑制濃度分別是1.56和0.13 mmol·L-1。甘珀酸對微動脈細(xì)胞間縫隙連接的抑制效力更強(qiáng)。

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),奎寧和甘珀酸能夠濃度依賴地抑制豚鼠腸系膜動脈段上平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道。此結(jié)果由以下兩點(diǎn)證實(shí):①奎寧和甘珀酸能夠使微動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電導(dǎo)和膜電容減少至單個(gè)細(xì)胞水平;②由Step電壓刺激引起的細(xì)胞膜充放電由單指數(shù)方程去擬合效果較差,提示更多的細(xì)胞通過縫隙連接通道參與了記錄平滑肌細(xì)胞膜的充放電過程,而給予奎寧和甘珀酸后記錄細(xì)胞與相鄰細(xì)胞間的縫隙連接通訊被阻斷后單指數(shù)方程則擬合很好[14-15]。

圖2 甘珀酸(A)和奎寧(B)凈電流I/V曲線a,c為未使用甘珀酸和奎寧下平滑肌細(xì)胞的I/V曲線;b,d為應(yīng)用甘珀酸和奎寧后平滑肌細(xì)胞的I/V曲線Fig.2 Carbenoxolone(A)and quinine(B)-induced net current I/V curvesa,c.the I/V curves of smooth muscle cells in the absence of carbenoxolone and quinine;b,d.the I/V curves of smooth muscle cells in the presence of carbenoxolone and quinine

圖3 甘珀酸(A)和奎寧(B)濃度依賴的抑制腸系膜動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電導(dǎo)

前期有報(bào)道稱在培養(yǎng)的神經(jīng)瘤母細(xì)胞上奎寧能夠選擇性和可逆的阻斷分別由Cx36和Cx50構(gòu)成的縫隙連接通道,半數(shù)抑制濃度分別為32和73 μmol·L-1。高濃度的奎寧(300 μmol·L-1)亦可阻斷表達(dá)Cx45的神經(jīng)瘤母細(xì)胞間縫隙連接通訊。但是對由Cx26、Cx32、Cx40或Cx43組成的縫隙連接通道沒有影響[10-11]。在人突變成纖維細(xì)胞系上甘珀酸能夠阻斷細(xì)胞間縫隙連接[12]。本研究發(fā)現(xiàn)奎寧和甘珀酸能夠濃度依賴和可逆的阻斷腸系膜動脈細(xì)胞間縫隙連接通訊,進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)果。此外,前期的研究結(jié)果主要在培養(yǎng)的細(xì)胞上進(jìn)行,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能一定適用于在體標(biāo)本,并且由于不同部位表達(dá)連接蛋白的種類和功能存在差異,因此前期所獲結(jié)果并不能適用于血管標(biāo)本。血管微動脈表達(dá)Cx37、Cx40、Cx43和Cx45等4種連接蛋白,其中內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)Cx37、Cx40和Cx43,平滑肌細(xì)胞上主要表達(dá)Cx37、Cx43和Cx45[4]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,筆者推測在腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞間主要表達(dá)由Cx45構(gòu)成的縫隙連接,傳遞細(xì)胞間的電化學(xué)信息,保證血管舒縮同步。

縫隙連接是細(xì)胞間進(jìn)行直接物質(zhì)交換和信息通訊的唯一途徑,能夠允許Na+、K+、Ca2+、H+以及相對分子質(zhì)量＜1 000的分子(cAMP、Ca2+、IP3)[16]等自由通過。縫隙連接參與了多種正常生理功能,如個(gè)體發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖/分化/凋亡、細(xì)胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等?？p隙連接也與血管緊張度的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[5],通過縫隙連接電化學(xué)信號的直接交流,使血管能夠保持電和機(jī)械活動的同步性,對刺激信息作出統(tǒng)一的反應(yīng),保證血管功能的穩(wěn)定和一致。病理情況下,傷害性信息也可通過縫隙連接傳遞至正常細(xì)胞引起病理性改變[5],縫隙連接阻斷藥能夠阻止其發(fā)生。SALTMAN等[17]報(bào)道應(yīng)用縫隙連接阻斷藥庚醇通過阻斷心肌細(xì)胞間的縫隙連接通訊,能夠顯著減少梗死面積。因此,縫隙連接阻斷藥在治療心血管疾病中將會是非常重要的工具。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.002

Effect of Quinine and Carbenoxolone on Gap Junction of Vascular Smooth Muscle Cells in Guinea Pig

ZHANG Zhi-ping1,SI Jun-qiang1,LI Xin-zhi2,LI Li1,WEI Li-li1,MA Ke-tao1
(1.Department of Physiology; 2.Department of Pathophysiology,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Objective To investigate the influence of quinine and carbenoxolone on gap junction channel in vascular smooth muscle cells of acutely isolated mesenteric artery(MA)segments in support of the development of gap junction inhibitors.MethodsThe whole-cell patch clamp was used to study the effect of quinine and carbenoxolone on membrane input capacitance (Cinput),membrane input conductance(Ginput)or membrane input resistance(Rinput)of vascular smooth muscle cells embedded in arteriole segments.ResultsThe Cinput and Ginput of in situ cells of MA were about 10 times of the dispersed cell.Quinine and carbenoxolone concentration-dependently and reversibly suppressed Ginput or increased Rinput,with a half maximal inhibitory concentration(IC50)of 1.56 mmol·L-1and 0.13 mmol·L-1in acutely isolated MA segments,respectively.After application of quinine(≥3 mmol·L-1)or carbenoxolone(≥0.3 mmol·L-1),the Cinput,Ginput and Rinput of the in situ cells were very close to the single dispersed cell in MA.ConclusionQuinine and carbenoxolone inhibit gap junction channel in vascular smooth muscle cells of MA in a concentration-dependent manner,in which carbenoxolone is more powerful than quinine.

Mesenteric artery;Quinine;Carbenoxolone;Gap junction;Patch clamp

R331.3;R965

A

1004-0781(2014)03-0279-05

2013-05-14

2013-06-20

*國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2012CB526600);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31100829, 31260247,81260519,81000411)

張治平(1977-),男,甘肅定西人,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:循環(huán)生理。電話:0993-2858458,E-mail：746691675@qq.com。

馬克濤(1979-),男,河北唐山人,副教授,博士,研究方向:循環(huán)生理。電話:0993-2057137,E-mail：maketao@hotmail.com。