宋兆華，朱寶安

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校，漯河 462002)

馬鞭草總黃酮對大鼠膿毒性急性肺損傷的保護機制

宋兆華，朱寶安

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校，漯河 462002)

目的 觀察馬鞭草總黃酮對大鼠膿毒性急性肺損傷(ALI)的保護作用和機制。方法將120只大鼠隨機分為6組,分別為假手術(shù)組(0.9%氯化鈉溶液),模型組(0.9%氯化鈉溶液),地塞米松陽性對照組(2.0 mg·kg-1,ip),馬鞭草總黃酮低、中、高劑量組(50.0,100.0,150.0 mg·kg-1,ip),盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥誘發(fā)ALI大鼠模型,造模24 h后給藥,48 h后處死,觀察支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞、蛋白含量和肺濕/干質(zhì)量比(W/D),比較炎癥遞質(zhì)水平、抗氧化作用以及肺組織核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)p65表達和細胞凋亡率。結(jié)果馬鞭草總黃酮能顯著降低BALF中白細胞、蛋白含量和肺組織W/D(P＜0.05或P＜0.01),降低巨噬細胞炎癥蛋白-2(MIP-2)、細胞間黏附分子-1 (ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平(P＜0.05或P＜0.01)以及肺組織細胞凋亡率和NF-κB p65表達(P＜0.05或P＜0.01),改善丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和髓過氧化物酶(MPO)活性(P＜0.05或P＜0.01)。尤其高劑量組效果明顯(P＜0.01)。結(jié)論馬鞭草總黃酮能降低膿毒性急性肺損傷大鼠的炎癥遞質(zhì)水平,減輕脂質(zhì)過氧化,改善肺泡毛細血管通透性,緩解ALI的發(fā)生、發(fā)展。

馬鞭草總黃酮；損傷,肺,急性；膿毒性；保護機制

膿毒癥是以感染為誘因的全身炎癥反應綜合征,表現(xiàn)為多臟器功能障礙和衰竭,其中肺臟最易受損,出現(xiàn)急性肺損傷(acute lung injury,ALI)或急性呼吸窘迫綜合征[1]。肺泡毛細血管通透性、肺組織細胞凋亡[2]、巨噬細胞、中性粒細胞以及內(nèi)皮細胞釋放的大量促炎因子、炎癥遞質(zhì)和趨化因子等在ALI的病理生理過程中起著關鍵作用。馬鞭草(Verbena ofieinalisL.)為馬鞭科植物馬鞭草的全草或帶根全草,黃酮化合物是馬鞭草中的主要活性成分之一,具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎作用[3]。筆者在本研究中通過盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation andpuncture,CLP)建立膿毒癥誘發(fā)ALI大鼠模型,探討馬鞭草總黃酮對膿毒癥后ALI的保護作用及機制,為ALI的臨床治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠120只,清潔級,雄性,體質(zhì)量180～200 g,河南實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(豫)2010-0002。動物質(zhì)量合格證號:0000897。

1.2 藥品和試劑 馬鞭草總黃酮(total flavones ofVerbena ofieinalisL.,TFV)由漯河醫(yī)學高等?？茖W校天然藥物化學實驗中心提供,黃酮含量＞87.5%,0.9%氯化鈉溶液配成所需濃度；地塞米松,購自天津天藥藥業(yè)股份有限公司(批號:110803)。巨噬細胞炎癥蛋白-2 (macrophage inflammatory protein,MIP-2)、細胞間黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule,ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號分別為: 110923,111201,120312,111209,120112,120213)。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)免疫組化試劑盒,購自北京中山生物技術(shù)公司(批號:110823)；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)檢測試劑盒,購自美國Roche公司(批號:120102)。

1.3 儀器 紫外-可見分光光度計(日本島津)；550型酶標儀(Bio-Rad公司)；GL-7000型全自動生化分析儀(日本島津公司)；GL20A型自動高速冷凍離心機(湖南湘江儀器廠)；AL104型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Olympus BX41系統(tǒng)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 模型的制備和分組 將120只SD大鼠隨機分為6組:假手術(shù)組(SHAM組),膿毒癥誘發(fā)ALI模型組(CLP組),地塞米松陽性對照組(DXMS組)和馬鞭草總黃酮組低、中、高劑量組(TFV組:LTFV組、MTFV組、HTFV組)。均1%戊巴比妥鈉80 mg·kg-1腹腔注射麻醉,假手術(shù)組大鼠開腹后立即關腹,模型組、陽性對照組和TFV組均采用CLP穿刺術(shù)制備大鼠膿毒癥模型[4]。24 h后,大鼠出現(xiàn)倦怠、嗜睡、煩躁、呼吸急促、四肢末梢發(fā)紺,同時走路不穩(wěn)、頭顫等,并伴隨豎毛、腹瀉等。剖腹可見惡臭味血性滲液,腸管水腫,確定造模成功。

1.5 劑量的確定 參照《藥理實驗方法學》,預實驗對大鼠經(jīng)腹腔注射毒性試驗測定大鼠對馬鞭草總黃酮的最大耐受量(1 g·kg-1)以確定給藥量,用其1/10作為中劑量,高、低劑量各為中劑量的3/2倍和1/2倍。

1.6 給藥方法 造模24 h后,馬鞭草總黃酮組按照50.0,100.0,150.0 mg·kg-1,ip；假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液2 mL·kg-1,ip；陽性對照組給予地塞米松2.0 mg·kg-1,ip。

1.7 支氣管肺泡灌洗液蛋白質(zhì)、白細胞測定 各組大鼠給藥48 h,戊巴比妥鈉50 mg·kg-1,ip麻醉。行氣管插管,抽取0.9%氯化鈉溶液灌洗支氣管肺泡,每次3 mL,共 6次,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),離心,Lowry法測定上清液蛋白濃度。沉淀細胞用溶紅細胞液破壞紅細胞后采用血細胞計數(shù)板在光學顯微鏡下計數(shù)白細胞(white blood cell,WBC)。

1.8 肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D) 取右肺上葉,吸干表面水分稱濕質(zhì)量,置于80℃烤箱72 h烘干稱干質(zhì)量,計算W/D。

1.9 肺組織部分生化指標的測定 取右肺下葉250 mg冰浴勻漿制成10%溶液,4℃、12 000 r·min-1離心15 min,取上清液檢測MIP-2,ICAM-1,TNF-α以及MDA、SOD和MPO的含量。

1.10 肺組織細胞凋亡檢測和NF-κB p65的表達 左肺組織,用甲醛溶液固定,按常規(guī)方法石蠟包埋,切片,原位末端標記法測定肺組織細胞凋亡,免疫組化測定NF-κB p65的陽性表達。

1.11 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用One-way ANOVA,兩兩比較采用SNK法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF中白細胞、蛋白含量和肺組織W/D的變化 與CLP組比較,SHAM組、DXMS組、TFV組BALF中白細胞、蛋白含量和肺組織W/D均差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其中TFV組伴隨劑量的加大,差異性更加明顯。HTFV組BALF中的白細胞、蛋白含量和肺組織W/D最低,與LTFV組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但與MTFV組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 大鼠肺組織MIP-2、ICAM-1、TNF-α含量的變化 與CLP組比較,SHAM組、DXMS組、TFV組MIP-2,ICAM-1,TNF-α水平均差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其中TFV組伴隨劑量的加大,差異性更加明顯。TFV組組內(nèi)比較,HTFV組MIP-2、ICAM-1、TNF-α的水平均最低,與LTFV組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與MTFV組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

2.3 肺組織中MDA、SOD和MPO變化 與CLP組比較,SHAM組、DXMS組、TFV組MDA、MPO、SOD水平均差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中TFV組伴隨劑量的加大,差異性更加明顯。TFV組組內(nèi)比較,HTFV組MDA和MPO水平最低,與LTFV組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與MTFV組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表1 6組大鼠BALF中白細胞和蛋白含量、肺組織W/D比較Tab.1 Comparison of leukocyte,protein content and W/D of lung tissue among six groups of rats ±s

表1 6組大鼠BALF中白細胞和蛋白含量、肺組織W/D比較Tab.1 Comparison of leukocyte,protein content and W/D of lung tissue among six groups of rats ±s

與CLP組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與LTFV組比較,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1)白細胞/(×107·L-1)蛋白含量/(mg·L-1)W/D LTFV組2050.05.11±0.35398.31±32.21*16.88±0.43 MTFV組20100.04.82±0.29*1331.23±31.22*26.06±0.37*1HTFV組20150.04.35±0.34*2*3307.26±28.57*2*35.38±0.31*2*3DXMS組202.04.29±0.31*2301.25±27.36*25.32±0.37*2CLP組200.05.68±0.26429.33±31.417.27±0.39 SHAM組200.04.18±0.27201.33±22.864.41±0.41

表2 6組大鼠肺組織MIP-2、ICAM-1、TNF-α含量的比較Tab.2 Comparison of MIP-2,ICAM-1,and TNF-α content in lung tissue among six groups of rats ±s

表2 6組大鼠肺組織MIP-2、ICAM-1、TNF-α含量的比較Tab.2 Comparison of MIP-2,ICAM-1,and TNF-α content in lung tissue among six groups of rats ±s

與CLP組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與LTFV組比較,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1) MIP-2/(Pg·mL-1) ICAM-1/(ng·mL-1) TNF-α/(μg·L-1) LTFV組2050.022.31±5.95312.24±78.43*1311.25±43.57*1MTFV組20100.016.98±5.13*2*3259.74±89.48*2*3244.37±39.67*1HTFV組20150.011.68±5.21*2*3209.59±63.38*2*3198.46±31.16*2*3DXMS組202.011.19±5.91*2211.00±57.16*2197.12±33.55*2CLP組200.030.41±7.17511.46±83.18383.27±46.65 SHAM組200.05.37±1.1145.17±11.1391.33±23.12

表3 6組大鼠肺組織中MDA、SOD和MPO活性變化比較Tab.3 Comparison of the activity of MDA,SOD and MPO in lung tissue among six groups of ratsv ±s

與CLP組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與LTFV組比較,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1) MDA/(mmol·mg-1) SOD/(U·mg-1) MPO/(U·g-1) LTFV組2050.00.97±0.13152.71±20.110.59±0.17 MTFV組20100.00.83±0.17*1169.53±20.17*2*30.46±0.18*1HTFV組20150.00.76±0.14*2*3179.28±21.08*2*30.32±0.12*2*3DXMS組202.00.67±0.14*2175.81±20.18*20.33±0.15*2CLP組200.01.28±0.16107.83±21.160.66±0.19 SHAM組200.00.61±0.19213.33±10.140.29±0.11

2.4 大鼠肺組織細胞凋亡率和NF-κB p65的表達結(jié)果 TUNEL檢測結(jié)果顯示,CLP組有較多的陽性細胞,其中細胞棕黃色染色者為陽性細胞。SHAM組有少量的陽性細胞。DXMS組陽性細胞明顯減少。而TFV組伴隨劑量的增加,陽性細胞的表達也在不斷的減少,尤其是HTFV組,陽性細胞表達明顯減少。見圖1。與CLP組比較,SHAM組、DXMS組、TFV組肺組織細胞凋亡率和NF-κB p65表達均差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中TFV組伴隨劑量的加大,差異性更加明顯。TFV組組內(nèi)比較,HTFV組細胞凋亡率和NF-κBp65表達最低,與LTFV組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與MTFV組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表4。

3 討論

CLP術(shù)是誘導膿毒癥的經(jīng)典方案,術(shù)后腹腔糞便的漏出產(chǎn)生局部感染灶,細菌大量繁殖和內(nèi)毒素的釋放激發(fā)宿主防御反應,誘發(fā)全身性炎癥反應,產(chǎn)生大量炎癥因子,啟動炎癥級聯(lián)反應[5]。炎癥因子能直接損傷靶器官,肺是膿毒癥最易損傷的器官,能通過促進脂質(zhì)過氧化、中性粒細胞的遷移和活化對肺組織產(chǎn)生損害作用及肺水腫[6]。

表4 6組大鼠肺組織細胞凋亡率和NF-κB p65表達的變化Tab.4 Comparison of cell apoptosis rate and NF-κB p65 expression in lung tissue among six groups of rats ±s

表4 6組大鼠肺組織細胞凋亡率和NF-κB p65表達的變化Tab.4 Comparison of cell apoptosis rate and NF-κB p65 expression in lung tissue among six groups of rats ±s

與CLP組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與LTFV組比較,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1)凋亡率/% NF-κB p65 LTFV組2050.036.27±1.7843.97±3.75*1MTFV組20100.027.44±1.56*132.53±4.42*1HTFV組20150.010.33±1.28*2*328.27±4.38*2*3DXMS組202.010.23±4.98*227.16±4.48*2CLP組200.041.31±5.2851.47±4.57 SHAM組200.08.58±0.879.63±2.15

ALI是因機體全身性炎癥反應導致的器官損傷。其中NF-κB p65是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其活性上調(diào)可激活MIP-2、ICAM-1、TNF-α等炎性因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,使中性粒細胞趨化、粘附、活化[7]。TNF-α的過表達促進MIP-2的分泌,增強白細胞的聚集和中性粒細胞的活化和浸潤,促進其他炎癥因子的釋放,炎癥的刺激上調(diào)肺部血管內(nèi)皮細胞ICAM-1的表達,浸潤到炎癥部位的中性粒細胞增加,組織損傷加重[8]。機體免疫功能紊亂,進一步引發(fā)肺組織肺泡上皮細胞的凋亡的發(fā)生[9]。本文數(shù)據(jù)顯示,CLP組肺組織MIP-2、ICAM-1、TNF-α水平和NF-κB p65表達以及肺組織上皮細胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組,表明肺部組織產(chǎn)生嚴重的炎癥反應,并引發(fā)炎癥連鎖反應,局部中性粒細胞浸潤,炎性滲出以及炎癥反應加重,結(jié)果BALF中白細胞、蛋白含量和肺組織W/D明顯提高。

A.LTFV組;B.MTFV組;C.HTFV組;D.DXMS組;E.CLP組;F.SHAM組圖1 6組大鼠肺組織細胞凋亡TUNEL法檢測圖(×400)A.LTFV group；B.MTFV group；C.HTFV group；D.DXMS group；E.CLP group；F.SHAM groupFig.1 Images of cell apoptosis of lung tissue in six groups of rats by TUNEL method(×400)

ALI常伴隨巨噬細胞和中性粒細胞激活和呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的氧自由基,過量自由基可使生物膜中的不飽和脂肪酸過氧化形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA[10],MDA產(chǎn)生增加,體內(nèi)抗氧化的SOD減少,抗氧化能力下降。其中MPO作為中性粒細胞活化的標志酶,其活性的變化反應了中性粒細胞的激活程度[11],SOD作為機體內(nèi)重要的氧自由基清除劑,具有極強的抗氧化作用,能清除體內(nèi)超氧陰離子、自由基保護細胞免受損傷[12-13]。

本研究顯示,馬鞭草總黃酮具有較好的抗氧化作用和抗炎作用,減少中性粒細胞在肺組織中粘附和遷移以及炎性滲出,降低BALF中清蛋白和白細胞含量和肺泡毛細血管膜的高通透性,減少細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子MIP-2表達,抑制中性粒細胞的遷移和白細胞的釋放,降低ICAM-1的表達從而達到抑制中性粒細胞與組織的粘附作用,改善肺水腫程度。促進SOD的表達,提高小鼠體內(nèi)清除自由基的能力,降低脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA及MPO等介質(zhì)的釋放。同時馬鞭草總黃酮能下調(diào)NF-κB p65的表達,減少促炎癥因子TNF-α的生成,控制炎癥的級聯(lián)反應,從而達到降低肺組織上皮細胞凋亡率,改善肺組織功能。

綜上所述,馬鞭草總黃酮能有效降低膿毒性急性肺損傷大鼠的炎癥遞質(zhì)水平,減輕脂質(zhì)過氧化,改善肺泡毛細血管通透性,減輕中性粒細胞浸潤及炎性滲出,發(fā)揮一定的肺臟保護作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.005

Protection Mechanism of the Total Flavonoids from Verbena on Rats with Septic Acute Lung Injury

SONG Zhao-hua,ZHU Bao-an
(Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

Objective To observe the protective effect and mechanism of the total flavonoids ofverbenaon rats with septic acute lung injury(ALI).MethodsA total of 120 rats were randomly divided into sham operation group(0.9% sodium chloride solution),model group(0.9%sodium chloride solution),dexamethasone positive control group (2.0 mg·kg-1,ip),low,middle and high dose of the total flavonoids ofverbenagroup(50.0,100.0,150.0 mg·kg-1,ip). Rat model with ALI was induced by Cecal ligation and puncture(CLP).The rats were injected with physiological saline, dexamethasone,low,middle and high dose of the total flavonoids ofverbena,respectively 24 h after establishment of the ALI model,and executed 48 h later.Bronchoalveolar lavage fluid(BALF)changes in leukocyte,protein content and the lung tissue wet to dry weight ratio(W/D)were observed,and the levels of inflammatory mediators,oxidation stress and nuclear transcription factor(NF-κB)p65 expression and cell apoptosis in lung tissue were compared.ResultsTotal flavonoids ofverbenasignificantly decreased leukocytes,protein content and W/D in BALF(P＜0.05 orP＜0.01),decreased microphage inflammation protein-2(MIP-2),intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and apoptotic rate of lung cells and expression of NF-κB p65(P＜0.05 orP＜0.01),and improved MDA content,activity of superoxide dismutase(SOD)and myeloperoxidase(MPO)(P＜0.05 orP＜0.01).The effects were the greatest in the high dose group(P＜0.01).ConclusionThe total flavone ofverbenacan reduce the levels of inflammatory mediators,reduce lipid peroxidation, improve the alveolar capillary permeability,and alleviate the occurrence and development of ALI.

Total flavonoids fromverbena;Injury,lung,acute;Septic;Protection mechanism

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0429-05

2013-03-25

2013-10-08

宋兆華(1981-),男,河南漯河人,講師,碩士,從事人體解剖學教學與研究。電話:(0)13938013804,E-mail：szhualh@163.com。