小柴胡湯對2型糖尿病小鼠的作用研究

齊密霞1,寧花蘭2,楊艷芳3,呂麗燕4,賀敬波1
(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 1.中醫(yī)科；2皮膚科；3功能科,深圳 518101；4.深圳市第五人民醫(yī)院,深圳 518100)

目的 研究小柴胡湯對2型糖尿病小鼠的影響,并探討其作用機制。方法采用高脂飼料喂養(yǎng)并腹腔注射鏈脲佐菌素建立2型糖尿病小鼠模型,分別給予羅格列酮,小柴胡湯低、中、高劑量及等體積的0.9%氯化鈉溶液。每周測定小鼠血糖,4周后進行口服糖耐量測試,6周后檢測血清胰島素、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白。采用Western blot檢測脂肪組織過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(Glut-4)。結(jié)果小柴胡湯能顯著降低小鼠血糖,改善口服糖耐量,并降低血清胰島素水平;可顯著降低小鼠低密度脂蛋白,升高高密度脂蛋白水平,但對總膽固醇和三酰甘油水平無影響;同時,小柴胡湯增加小鼠脂肪組織PPAR-γ和Glut-4水平。結(jié)論小柴胡湯能降低2型糖尿病模型小鼠的血糖,改善血脂紊亂,該作用可能與促進PPAR-γ和Glut-4水平、增加外周組織對胰島素敏感性有關。

小柴胡湯；糖尿病,2型；降血糖；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4

2型糖尿病是以胰島素抵抗和胰腺β細胞受損,外周組織對葡萄糖利用障礙為特征的代謝綜合征,多在35～40歲之后發(fā)病,占糖尿病患者90%以上[1]。患者多以口服降糖藥與食療、運動相結(jié)合控制病情[2-4]。中藥以其療效確切、溫和、無毒的特點,在治療糖尿病方面具有悠久歷史,已報道有多種中草藥在降糖、調(diào)脂及其并發(fā)癥方面發(fā)揮重要作用[5]。小柴胡湯在東漢張仲景著《傷寒雜病論》、《金匱要略》及《黃帝內(nèi)經(jīng)》中均有記載,由柴胡、人參、黃芩、半夏、甘草、生姜、大棗7味藥組成,是和解少陽的代表方劑[6]。該方臨床作用廣泛,具有抗肝損害、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[7]。近年來,臨床上通過加減此方,在糖尿病及其并發(fā)癥治療上獲得良效,但作用機制尚不甚清楚[8]。筆者采用高脂飲食合并小劑量鏈脲佐菌素單次腹腔注射的方法建立2型糖尿病模型,研究小柴胡湯對2型糖尿病小鼠的作用,并通過檢測過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ, PPAR-γ)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(glucose transporter, Glut-4),探討小柴胡湯降糖作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 小鼠Glut-4單克隆抗體(Santa Cruz公司)；小鼠PPARγ單克隆抗體(Santa Cruz公司)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(eBioscience公司,美國)；三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司):JPS-5怡成血糖測定儀(北京怡成醫(yī)療器械有限公司),低溫高速離心機(HermLe公司,德國),臺式恒溫振蕩器(太倉華美生化儀器廠),AVE型半自動生化分析儀(愛威科技實業(yè)有限公司),MV-Ⅱ型雙垂直板式電泳槽(大連競邁生物科技有限公司),MK酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司,芬蘭),高速冷凍離心機(HERMLE,德國)。

1.2 藥物 小柴胡湯煎劑制備:柴胡24 g,黃芩9 g,清半夏9 g,甘草9 g,人參9 g,大棗12 g,購于深圳市第八人民醫(yī)院門診部中藥房,加水300 mL浸泡30 min后煎煮40 min,去藥渣,再煎煮40 min,60℃恒溫濃縮成1 mL含生藥2.5 g,4℃保存,使用前37℃水浴。

1.3 實驗動物 雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量20～22 g,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,動物許可證號: SCXK(粵)2008-0002。

1.4 2型糖尿病動物模型的建立 雄性BABL/c小鼠,適應性喂養(yǎng)1周,隨機分為空白對照組和模型組。其中空白對照組小鼠給予正常飼料喂養(yǎng),模型組動物給予高脂飼料喂養(yǎng)(膽酸鈉0.5%,膽固醇1%,豬油5%,蛋黃粉10%,基礎飼料83.5%),連續(xù)8周。8周后,模型組動物一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)50 mg·kg-1,建立2型糖尿病模型。給予STZ 5 d后,選取血糖高于11.1 mmol·L-1的小鼠作為造模成功的糖尿病小鼠。

1.5 動物分組及給藥 造模成功的糖尿病小鼠50只,隨機分為5組:模型對照組、陽性對照組和小柴胡湯高、中、低劑量組,每組10只。另設空白對照組小鼠10只,與模型對照組小鼠具有相同周齡,給予普通標準小鼠飼料喂養(yǎng)。除空白對照組外,其余各組繼續(xù)喂以高脂飼料直至實驗結(jié)束。陽性對照組灌胃給予羅格列酮3.0 mg·kg-1·d-1,相當于臨床用量10倍；小柴胡湯低、中、高劑量組分別按生藥4,8,12 g·kg-1灌胃給藥；空白對照組和模型對照組灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液0.1 mL·(10g)-1。連續(xù)給藥6周,qd。

1.6 口服糖耐量測試 給藥4周后,小鼠禁食6 h,灌胃給予葡萄糖2 g·kg-1,分別在0,30,60,90,120 min采集小鼠尾靜脈血,通過快速血糖測試儀測定小鼠血糖。

1.7 血清生化指標測定 給藥6周后,測定小鼠體質(zhì)量,禁食6 h,采集小鼠尾靜脈血,通過快速血糖測試儀測定小鼠血糖。摘眼球取血,分離血清,-20℃凍存。檢測血清LDL、HDL、TC、TG,采用半自動生化分析儀測定,結(jié)果以mmol·L-1表示。血清胰島素測定按照ELISA試劑盒操作,結(jié)果以ng·mL-1表示。

1.8 脂肪組織中PPAR-γ和Glut-4測定 取脂肪組織100 mg,加細胞裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)1 mL提取蛋白,考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)濃度。取樣品蛋白50 μg,以SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),半干轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane,NC)膜,脫脂奶粉37℃,封閉4 h后,依次加入鼠的單克隆PPAR-γ一抗(稀釋度1∶1 000)、二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體,稀釋度為1∶5 000),洗滌后用增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯像曝光。Glut-4檢測方法同上。

1.9 統(tǒng)計學方法 用SPSS 11.3版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,采用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小柴胡湯對2型糖尿病小鼠血糖的影響 與空白對照組相比,模型對照組小鼠血糖持續(xù)升高,且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；小柴胡湯能明顯降低糖尿病小鼠血糖,呈劑量依賴性,高劑量組血糖降低程度與陽性對照組相當。小柴胡湯對2型糖尿病小鼠的作用與文獻報道對糖尿病人作用效果一致[8]。見圖1。

與模型對照組比較,*1P＜0.05圖1 小柴胡湯對2型糖尿病小鼠血糖的影響Compared with model control group,*1P＜0.05Fig.1 Effect of xiaochaihu decoction on blood glucose in type 2 diabetic mice

2.2 小柴胡湯對2型糖尿病小鼠口服糖耐量的影響 給藥4周后,進行口服糖耐量測試。與空白對照組比較,模型對照組在給予葡萄糖30 min,血糖顯著升高；小柴胡湯組可迅速降低30和60 min的血糖水平,該結(jié)果提示小柴胡湯可改善糖耐量。見圖2。

2.3 小柴胡湯對2型糖尿病小鼠血清生化指標影響

2型糖尿病患者因外周組織對胰島素敏感性降低導致血清胰島素升高。本研究中,2型糖尿病小鼠在實驗結(jié)束時血清胰島素水平高于空白對照組(P＜0.05)。給予小柴胡湯后,高劑量組血清胰島素含量明顯降低,表明其能改善動物高胰島素血癥狀態(tài),減輕胰島β細胞的負擔,從而間接對胰腺β細胞具有保護作用。但與模型對照組比較,低、中劑量組對血清胰島素的作用差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。此外,給予小柴胡湯6周后,能升高HDL水平,降低LDL水平,高劑量組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但對TC及TG無明顯作用。見表1。

與模型對照組比較,*1P＜0.05圖2 小柴胡湯對2型糖尿病小鼠口服糖耐量的影響Compared with model control group,*1P＜0.05Fig.2 Effect of xiaochaihu decoction on OGTT in type 2 diabetic mice

2.4 小柴胡湯對2型糖尿病小鼠脂肪組織PPAR-γ和Glut-4的影響 為評價小柴胡湯降糖作用機制,進一步采用Western blot檢測脂肪組織中PPAR-γ和Glut-4的含量,結(jié)果如圖3。與空白對照組相比,模型對照組脂肪組織中PPAR-γ和Glut-4含量顯著降低。而小柴胡湯各給藥組劑量依賴性增加PPAR-γ和Glut-4的含量,且高劑量組更明顯。

A.電泳圖;B.柱形圖;與模型對照組比較,*1P＜0.05圖3 小柴胡湯對2型糖尿病小鼠PPAR-γ和Glut-4的影響A.electrophotogram；B.histogram；comparedwithmodel control group,*1P＜0.05Fig.3 Effect of xiaochaihu decoction on PPAR-γ and Glut-4 in type 2 diabetes mice

3 討論

2型糖尿病的主要發(fā)病機制涉及胰島素抵抗和胰島β細胞受損,表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖的利用障礙[9]。本研究采用高脂飲食誘發(fā)胰島素抵抗狀態(tài),降低外周組織對胰島素的敏感性；同時采用低劑量STZ造成輕度胰島β細胞受損,血糖升高。該模型表現(xiàn)為血糖進行性升高,糖耐量異常,血脂代謝紊亂,與文獻報道一致[10]。小柴胡湯在臨床上治療糖尿病患者具有良好的效果,其在降低血糖的同時,可改善糖尿病患者肝氣郁結(jié)癥和胃功能紊亂等糖尿病綜合征。因此,本研究在臨床實踐的基礎上,研究小柴胡湯對STZ與高脂膳食誘導的2型糖尿病小鼠的治療作用。結(jié)果顯示,小柴胡湯在高劑量時可改善口服糖耐量,降低胰島素水平,從而有效控制血糖。

表1 小柴胡湯對血清生化指標的影響Tab.1 Effect of xiaochaihu decoction on serum biochemical indicators ±s

表1 小柴胡湯對血清生化指標的影響Tab.1 Effect of xiaochaihu decoction on serum biochemical indicators ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.05;與空白對照組比較,*2P＜0.05Compared with model group,*1P＜0.05;compared with blank control group,*2P＜0.05

組別胰島素/(ng·mL-1) LDLHDLTCTG (mmol·L-1)小柴胡湯低劑量組1.84±0.320.48±0.090.88±0.192.41±0.321.73±0.19中劑量組1.89±0.390.44±0.13*10.83±0.322.38±0.381.77±0.23高劑量組1.61±0.27*10.42±0.17*10.91±0.23*12.33±0.281.82±0.35陽性對照組1.59±0.24*10.40±0.13*10.97±0.18*12.10±0.29*10.92±0.09*1模型對照組1.91±0.22*20.49±0.10*20.82±0.13*22.39±0.43*21.93±0.14*2空白對照組1.27±0.120.35±0.121.10±0.092.18±0.310.88±0.11

2型糖尿病患者體內(nèi)游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)脂類升高導致β細胞胰島素代償功能進行降低, β細胞功能衰退,降低糖耐量,進一步加劇血糖紊亂[11]。本研究考察了小柴胡湯對血脂的作用,結(jié)果顯示,在給予小柴胡湯6周后,糖尿病小鼠HDL升高, LDL降低,但對TC和TG無明顯改善作用。HDL在血脂代謝過程扮演了重要的角色,其可將末梢組織游離膽固醇與血液循環(huán)中脂蛋白或與某些大分子結(jié)合從而運送至肝臟等組織,從而促進膽固醇的清除[12]。而在本研究中,在HDL升高的水平基礎上,膽固醇等血脂指標并未顯著降低,可能與實驗周期過短有關。小柴胡湯對血脂的改善作用,可保護血管內(nèi)皮細胞,降低2型糖尿病以微血管病變?yōu)樘卣鞯奶悄虿【C合征如糖尿病腎病。

此外,小柴胡湯在降低血脂的同時,可明顯升高脂肪組織中PPAR-γ和Glut-4的水平。PPAR-γ為一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,在脂肪組織高表達,通過促進脂肪組織分化從而減少肥大脂肪細胞的數(shù)量,增加代謝活性有助于小脂肪細胞攝取葡萄糖,此外還可促進線粒體解偶聯(lián)蛋白的表達,增強組織對葡萄糖的攝取,消耗能量從而改善胰島素抵抗狀態(tài)[13-14]。而Glut-4主要在骨骼肌和脂肪組織中表達,在胰島素刺激下,通過胰島素受體介導的胰島素信號通路,使Glut-4通過易位作用轉(zhuǎn)移至胞膜進而將葡萄糖轉(zhuǎn)運至細胞中[15-16]。2型糖尿病患者Glut-4的表達降低,導致葡萄糖轉(zhuǎn)運功能障礙是發(fā)生胰島素抵抗的主要原因[17]。小柴胡湯通過增加PPAR-γ的表達,增加胰島素敏感性,從而促進葡萄糖轉(zhuǎn)運及代謝過程。除小柴胡湯本身可促進Glut-4的增加, PPAR-γ信號通路的激活同樣可增強Glut-4的表達,從而促進葡萄糖的攝取,從而降低血糖。

綜上所述,本實驗結(jié)果證實小柴胡湯具有降低2型糖尿病小鼠的血糖、血脂作用。其降糖作用與增加PPAR-γ和Glut-4的表達有關,一方面促進游離脂肪的利用,增加外周組織對胰島素的敏感性；另一方面促進葡萄糖的攝取,從而有效控制高血糖高血脂癥狀。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.006

Study on the Effect of Xiaochaihu Decoction on Type 2 Diabetic Mice

QI Mi-xia1,NING Hua-lan2,YANG Yan-fang3,LV Li-ya4,HE Jing-bo1
(1.Department of Traditional Chinese Medicine;2.Department of Dermatology;3.Function Division,the People's Hospital of Bao'an,Shenzhen 518101,China;4.The Fifth People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen 518100,China)

Objective To study the effect ofχiaochaihudecoction on type 2 diabetes and its underlying mechanism.MethodsType 2 diabetic mice was induced by high-fat-diet and a single intraperitoneal injection of streptozotocin.The mice were orally given rosiglitazone,low,middle or high dose ofχiaochaihudecoction,or 0.9%sodium chloride solution,separately. Blood glucose was detected every week.After treatment for four weeks,oral glucose tolerance test(OGTT)was determined. Serum insulin,total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein(HDL),and low density lipoprotein(LDL) were tested after treatment for six weeks.Expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ)and glucose transporter 4(Glut4)in adipose tissue was investigated by Western blotting.ResultsXiaochaihudecoction significantly increased blood glucose and decreased serum insulin levels,and improved OGTT in type 2 diabetic mice.Treatment ofχiaochaihudecoction also exhibited lower LDL,higher HDL,but not improving TC and TG.Expression of PPARγ and Glut4 in the adipose tissue was higher afterχiaochaihudecoction treatment.ConclusionXiaochaihudecoction has hypoglycemic and hypolipidemic effects in type 2 diabetic mice,which may be related to the higher expression of PPARγ and Glut4 in adipose tissue,and enhanced insulin sensitivity in peripheral tissues.

Xiaochaihudecoction;Diabetes,type 2;Hypoglycemic effect;Peroxisome proliferator-activated receptor γ; Glucose transporter 4

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0434-05

2013-07-17

2013-09-12

齊密霞(1976-),女,河北井陘人,主治醫(yī)師,碩士,主要從中醫(yī)內(nèi)科、婦科臨床工作。電話:(0)13823643695；E-mail：qimixia@aliyun.com。

賀敬波(1968-),男,湖北隨州人,主任醫(yī)師,博士,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科臨床。電話:0755-27788311,E-mail：jingboh@21cn.com。