朱方擎，陳衛(wèi)國(guó)，陳杰，林浩，劉立璽，龔敏，文萍，文劍波

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院 1.消化內(nèi)科；2.藥學(xué)部，萍鄉(xiāng) 337000)

氧化苦參堿對(duì)肝硬化大鼠腸源性?xún)?nèi)毒素血癥的影響

朱方擎1，陳衛(wèi)國(guó)1，陳杰2，林浩1，劉立璽1，龔敏1，文萍1，文劍波1

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院 1.消化內(nèi)科；2.藥學(xué)部，萍鄉(xiāng) 337000)

目的 探究氧化苦參堿對(duì)肝硬化大鼠腸源性?xún)?nèi)毒素血癥的影響。方法使用四氯化碳(CCl4)進(jìn)行肝硬化大鼠模型制備,30只制備成功的肝硬化大鼠隨機(jī)分成兩組:治療組接受氧化苦參堿肌內(nèi)注射(63 mg·kg-1);模型組接受同等劑量5%葡萄糖溶液肌內(nèi)注射。另取10只健康大鼠作為正常組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取大鼠門(mén)靜脈血,使用鱟試劑盒,運(yùn)用動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)血漿樣品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè);取末段回腸組織,用ELISA試劑盒進(jìn)行腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)濃度的測(cè)定,并進(jìn)行光學(xué)顯微鏡下回腸組織病理學(xué)觀察。結(jié)果模型組內(nèi)毒素水平明顯高于正常組,氧化苦參堿治療后,治療組內(nèi)毒素水平明顯下降,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較,治療組回腸組織中TNF-α和IL-6的濃度顯著下降(P＜0.01)。模型組大鼠腸黏膜絨毛萎縮、脫落、斷裂,黏膜固有層甚至肌層可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),絨毛水腫嚴(yán)重,并可見(jiàn)肌層組織水腫疏松;治療組腸黏膜得到修復(fù),絨毛整齊,水腫減輕,黏膜層致密,浸潤(rùn)的炎細(xì)胞明顯減少。結(jié)論氧化苦參堿能降低肝硬化大鼠腸黏膜組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的濃度水平,改善腸黏膜屏障功能,從而減輕腸源性?xún)?nèi)毒素血癥。

氧化苦參堿；肝硬化；內(nèi)毒素血癥；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-6

肝硬化是臨床常見(jiàn)的慢性進(jìn)行性肝病,由一種或多種病因長(zhǎng)期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害。早期由于肝臟代償功能較強(qiáng)可無(wú)明顯癥狀,后期則以肝功能損害和門(mén)靜脈高壓為主要表現(xiàn),并有多系統(tǒng)受累,晚期常出現(xiàn)上消化道出血、肝性腦病、繼發(fā)感染、腹腔積液、肝腎綜合征等并發(fā)癥。研究證實(shí),腸源性?xún)?nèi)毒素血癥與肝硬化上述并發(fā)癥的發(fā)生關(guān)系密切[1]。大多數(shù)肝硬化患者可出現(xiàn)腸黏膜屏障功能損傷,使得腸源性?xún)?nèi)毒素透過(guò)腸黏膜屏障進(jìn)入血液循環(huán),形成腸源性?xún)?nèi)毒素血癥[2]。因此,尋找有效的治療方法來(lái)減輕肝硬化患者的內(nèi)毒素血癥日益受到重視。氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是傳統(tǒng)中藥草本苦參中的提取物,有多種藥理作用,抗炎作用是其最重要的藥理作用之一[3]。研究表明,OMT能抑制各種大鼠模型中細(xì)胞因子釋放[3-5]。因此,筆者假設(shè)OMT能通過(guò)抗炎作用保護(hù)腸黏膜屏障功能,從而減輕腸源性?xún)?nèi)毒素血癥。因而,筆者探討OMT在肝硬化腸源性?xún)?nèi)毒素血癥中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 50只SPF級(jí)雄性SD大鼠(合格證號(hào): 4304701345),體質(zhì)量180～220 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2003-0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(蘇)2002-0123。四氯化碳(CCl4)溶液和醫(yī)用橄欖油購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒(批號(hào):130308)購(gòu)自廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào): E02T0008、E02I0006)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；苦參素注射液(批號(hào):130312102)由江蘇正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供,規(guī)格:2 mL∶0.6 g。

1.2 造模、分組、藥物注射 取40只正常大鼠進(jìn)行肝硬化造模,采用40%CCl4橄欖油溶液(按2∶3比例配置)0.3 mL·kg-1,皮下注射,每周2次,按個(gè)體化原則,每只大鼠根據(jù)自身體質(zhì)量調(diào)整劑量,共12周[6]。最后制成肝硬化大鼠共30只,肝臟病理圖片見(jiàn)圖1。另取10只正常大鼠標(biāo)記為正常組(n=10)。造模成功大鼠分為模型組(n=15)和治療組(n=15)。治療組大鼠接受5%葡萄糖溶液配置的OMT肌內(nèi)注射(63 mg·kg-1)共4周,qd；正常組和模型組大鼠分別肌內(nèi)注射同等劑量5%葡萄糖溶液4周,qd。與此同時(shí),模型組與治療組大鼠繼續(xù)接受40%CCl4橄欖油溶液皮下注射至16周。16周實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后,所有大鼠使用3%水合氯醛進(jìn)行麻醉并解剖。收集門(mén)靜脈血樣品進(jìn)行保存,并取末段回腸組織存儲(chǔ)于液氮罐中備用。

圖1 大鼠肝臟HE染色病理圖片(A.×40;B.×200)Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of liver tissue (A.×40；B.×200)

1.3 血漿內(nèi)毒素水平測(cè)定 使用內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒,運(yùn)用動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)血漿樣品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。采集2 mL以上的靜脈血3 000 r·min-1離心60 s。取0.1 mL樣本上清液,加入0.9 mL樣本處理液中,混勻后70℃加熱10 min,之后立即冰浴3 min。取0.2 mL樣本混合液加入鱟試劑中,混勻后移取0.1 mL至96微孔板中上機(jī)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)回腸組織中TNF-α和IL-6的濃度 采用ELISA的方法檢測(cè)回腸組織中TNF-α和IL-6的濃度。將冰凍保存的回腸組織剪成碎片,加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)液中并進(jìn)行勻漿,然后用離心機(jī)5 000 r·min-1離心15 min,取上清液作為待測(cè)標(biāo)本。TNF-α和IL-6濃度檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出標(biāo)本濃度。

1.5 回腸組織病理學(xué)觀察 對(duì)末段回腸組織樣品進(jìn)行常規(guī)組織病理學(xué)觀察。使用0.9%氯化鈉溶液清洗回腸組織,然后用10%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下對(duì)黏膜損傷程度進(jìn)行評(píng)估,觀察絨毛排列是否整齊,黏膜有無(wú)水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。TNF-α和IL-6數(shù)據(jù)為計(jì)量資料,組間比較示方差齊,行單因素方差分析,均數(shù)間多重比較采用SNK檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls)；血漿內(nèi)毒素?cái)?shù)據(jù)為等級(jí)資料,使用秩轉(zhuǎn)換非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法中的H檢驗(yàn)法(Kruskal-Wallis H test)進(jìn)行比較,組間兩兩比較使用Nemenyi檢驗(yàn)法,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿內(nèi)毒素水平 見(jiàn)表1。模型組的內(nèi)毒素水平明顯高于正常組,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。模型組中有13只大鼠內(nèi)毒素水平＞0.035 EU·mL-1,而治療組中僅為7只,OMT治療后,治療組內(nèi)毒素水平顯著下降,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 3組大鼠血漿內(nèi)毒素水平比較Tab.1 Comparison of the serum endotoxin levels among three groups of rats 只

2.2 回腸組織中TNF-α和IL-6濃度水平 與正常組比較,模型組TNF-α和IL-6濃度水平明顯升高(P＜0.01)。OMT治療后,治療組TNF-α和IL-6濃度水平顯著下降,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠回腸組織中TNF-α和IL-6濃度比較Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in ileal tissue among three groups of rats pg·mL-1,±s

表2 3組大鼠回腸組織中TNF-α和IL-6濃度比較Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in ileal tissue among three groups of rats pg·mL-1,±s

與模型組比較,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

組別大鼠/只TNF-αIL-6治療組1597.83±17.79*178.07±24.94*1模型組15152.52±15.81118.82±35.71正常組1048.63±18.73*150.88±22.13*1

2.3 回腸組織病理學(xué)改變 正常組腸壁組織黏膜完整,絨毛排列整齊,腸黏膜僅有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖 2A)。模型組大鼠腸黏膜可見(jiàn)絨毛萎縮、變短、斷裂,并可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)于黏膜固有層甚至肌層；另外,可見(jiàn)絨毛嚴(yán)重水腫,黏膜層組織疏松(圖2B)。經(jīng)過(guò)OMT治療后,治療組大鼠腸黏膜絨毛整齊,水腫減輕,黏膜層更致密,浸潤(rùn)的炎細(xì)胞明顯減少(圖2C)。

3 討論

研究證實(shí),OMT能抑制各種大鼠模型細(xì)胞因子釋放,包括創(chuàng)傷性腦損傷、葡聚糖硫酸鹽鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎、腸道缺血-再灌注損傷和急性胰腺炎等模型[3-5]。雖然OMT有抗炎治療效果,但筆者未見(jiàn)OMT減少肝硬化大鼠腸黏膜中細(xì)胞因子的研究。本實(shí)驗(yàn)中,筆者假設(shè)OMT能夠減少肝硬化大鼠腸道組織中TNF-α和IL-6發(fā)揮其抗炎作用,從而改善腸黏膜屏障功能,減輕腸源性?xún)?nèi)毒素血癥。

A.正常組;B.模型組;C.治療組圖2 大鼠回腸病理切片(HE,×200)A.control group；B.model group；C.treatment groupFig.2 Hematoxylin and eosin staining of ileal tissue(HE,×200)

肝硬化腸黏膜屏障功能損傷的確切機(jī)制尚未闡明,但細(xì)胞因子在損傷中起了至關(guān)重要作用。在大量促炎遞質(zhì)中,TNF-α在腸屏障功能的生理調(diào)節(jié)中起重要作用[7-8]。此外,TNF-α可能是誘導(dǎo)諸如IL-6、IFN-γ等多種細(xì)胞因子產(chǎn)生的遞質(zhì),而這些細(xì)胞因子將加重腸屏障損傷。YANG等[6]研究結(jié)果證實(shí)了丹參多酚酸鹽通過(guò)抑制TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)修復(fù)了肝硬化大鼠腸黏膜的損傷。這表明TNF-α在腸黏膜屏障功能的損害中起了重要作用。除此之外,IL-6也是腸黏膜屏障損害的重要炎癥因子。DU PLESSIS等[9]的研究表明,肝硬化時(shí)腸道巨噬細(xì)胞呈激活表型,將引起iNOS表達(dá)和NO、IL-6分泌,從而破壞腸黏膜屏障功能。近來(lái),有研究表明,IL-6能改變培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-2的表達(dá)和腸道通透性,這闡明了腸道局部炎癥和腸道通透性的確切關(guān)聯(lián)[10]。因此, TNF-α和IL-6是肝硬化腸黏膜屏障損傷中的重要炎癥因子。本實(shí)驗(yàn)中,筆者觀察到模型組腸道組織中TNF-α、IL-6濃度水平明顯提高,腸黏膜屏障功能損害嚴(yán)重,腸源性?xún)?nèi)毒素血癥嚴(yán)重；經(jīng)過(guò)OMT治療后,TNF-α、IL-6濃度水平顯著下降,腸黏膜屏障功能得到改善,腸源性?xún)?nèi)毒素血癥減輕。

總之,OMT通過(guò)降低腸黏膜細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的濃度水平,改善腸黏膜屏障功能,從而減輕腸源性?xún)?nèi)毒素血癥。此外,OMT可能具有對(duì)腸道內(nèi)毒素的直接清除作用,從而減少腸源性?xún)?nèi)毒素血癥的發(fā)生。當(dāng)然, OMT減輕腸源性?xún)?nèi)毒素血癥的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 鐘轉(zhuǎn)華,陳渝萍.內(nèi)毒素與肝硬化并發(fā)癥的關(guān)系及其治療進(jìn)展[J].臨床薈萃,2010,25(4):366-368.

[2] WIEST R,GARCIA-TSAO G.Bacterial translocation(BT) in cirrhosis[J].Hepatology,2005,41(3):422-433.

[3] ZHAO J,YU S,TONG L,et al.Oxymatrine attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury in rats[J].Surg Today, 2008,38(10):931-937.

[4] DONG X Q,YU W H,HU Y Y,et al.Oxymatrine reduces neuronal cell apoptosis by inhibiting Toll-like receptor 4/nuclear factor kappa-B-dependent inflammatory responses in traumatic rat brain injury[J].Inflamm Res,2011,60(6): 533-539.

[5] ZHANG Z,WANG Y,DONG M,et al.Oxymatrine ameliorates L-arginine-induced acute pancreatitis in rats[J]. Inflammation,2012,35(2):605-613.

[6] YANG D H,YE Z Y,JIN B,et al.Salvianolate inhibits cytokine gene expression in small intestine of cirrhotic rats [J].World J Gastroenterol,2011,17(14):1903-1909.

[7] WANG F,GRAHAM W V,WANG Y,et al.Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression[J].Am J Pathol, 2005,166(2):409-419.

[8] TIEGS G,WOLTER M,WENDEL A.Tumor necrosis factor is a terminal mediator in galactosamine/endotoxin-induced hepatitis in mice[J].Biochem Pharmacol,1989,38(4): 627-631.

[9] DU PLESSIS J,VANHEEL H,JANSSEN C E,et al.Activated intestinal macrophages in patients with cirrhosis release NO and IL-6 that may disrupt intestinal barrier function[J].J Hepatol,2013,58(6):1125-1132.

[10] SUZUKI T,YOSHINAGA N,TANABE S.Interleukin-6(IL-6)regulatesclaudin-2expressionandtightjunction permeability in intestinal epithelium[J].J Biol Chem, 2011,286(36):31263-31271.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.007

Effect of Oxymatrine on Enterogenous Endotoxemia in Cirrhotic Rats

ZHU Fang-qing1,CHEN Wei-guo1,CHEN Jie2,LIN Hao1,LIU Li-xi1,GONG Min1,WEN Ping1,WEN Jian-bo1
(1.Department of Gastroenterology;2.Department of Pharmacy,The Affiliated Pingχiang Hospital of Southern Medical University,Pingχiang 337000,China)

Objective To investigate the effect of oxymatrine on enterogenous endotoxemia in rats with cirrhosis.MethodsThirty rats with carbon tetrachloride(CCl4)-induced cirrhosis were randomly divided into two groups:the treatment group,who received oxymatrine intramuscular injection(63 mg·kg-1);and the model control group,who received the same volume of 5%glucose solution.Another 10 healthy rats served as the normal control group.At the end of the experiment,serum samples were taken from the portal vein for the detection of endotoxin level with a Kinetic Turbidimetric Limulus Amebocyte Lysate Kit.Concentration of TNF-α and IL-6 in the ileum tissue was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). A piece of terminal ileum was also sampled for histopathologic examination.ResultsThe serum endotoxin level was significantly elevated in the model control group than the normal control group.After the treatment with oxymatrine,the serum endotoxin level was significantly decreased compared with the model control(P＜0.01).Administration of oxymatrine resulted in a significant reduction in the concentration of TNF-α and IL-6 compared with the model control group(P＜0.01).The intestinal mucosal villi in rats of the model control group were atrophic,shorter,fractured,and infiltrated with inflammatory cells into the lamina propria and even muscular layer.The swelling of the villi was serious and structure of mucous membrane became loose. This observation was reversed in the treatment group.ConclusionOxymatrine decreased enterogenous endotoxemia in cirrhotic rats by reducing the concentration of TNF-α and IL-6 and improving intestinal barrier function.

Oxymatrine;Cirrhosis;Endotoxemia;Tumor necrosis factor-α;Interleukin-6

R287;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0438-04

2013-10-15

2014-01-20

朱方擎(1989-),男,江西贛州人,在讀碩士,研究方向:肝硬化腸黏膜屏障功能。電話:0799-6881797,E-mail：195375529@qq.com。

文劍波(1963-),男,江西萍鄉(xiāng)人,碩士生導(dǎo)師,研究方向:腸黏膜屏障功能。電話:0799-6881797,E-mail：wenjbpx@126.com。