李冬兵 趙 凱 劉 學(xué)鋒 王 一 曾 澤彬

(宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌蠶桑研究所，四川宜賓 6 44600)

氟化物添食對(duì)家蠶耐氟品種和敏感品種5齡幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶含量的影響

李冬兵 趙 凱 劉 學(xué)鋒 王 一 曾 澤彬

(宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌蠶桑研究所，四川宜賓 6 44600)

為探明家蠶耐氟化物機(jī)理，以家蠶耐氟品種T6和敏感品種734為材料，通過(guò)人工添食NaF的方法測(cè)定了其血液與中腸組織蛋白質(zhì)及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活力。結(jié)果表明:隨著NaF添食濃度的增加，敏感品種734血液蛋白質(zhì)濃度低于耐氟品種T6血液蛋白質(zhì)濃度，而兩者中腸組織的蛋白質(zhì)濃度無(wú)明顯差異。敏感品種734血液及中腸組織的GSTs酶活力呈現(xiàn)幅度較大的波動(dòng);耐氟品種T6血液中的GSTs酶活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，中腸組織的GSTs酶活力波動(dòng)的幅度較小。由此可見(jiàn)，耐氟家蠶品種能夠在氟化物的調(diào)控下提高體內(nèi)GSTs的含量，推測(cè)其為耐氟家蠶品種具有氟化物抗性的原因之一。

家蠶;氟化物;耐氟品種;敏感品種;谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶;抗性

氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，其廣泛存在于自然界中。氟化物對(duì)家蠶具有較強(qiáng)的毒害作用，可與家蠶細(xì)胞、組織及器官相互作用，引發(fā)一系列生物物理或生物化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致效應(yīng)器官生理機(jī)能下降，最終導(dǎo)致家蠶死亡。當(dāng)前，我國(guó)工業(yè)飛速發(fā)展，大氣氟污染也隨之日益嚴(yán)重，蠶區(qū)家蠶氟化物中毒事件時(shí)有發(fā)生，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，選育耐氟化物家蠶品種顯得尤為重要。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一類多基因家族編碼的解毒酶，其主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來(lái)有害物質(zhì)的親電基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基結(jié)合，形成更易溶解的、沒(méi)有毒性的衍生物，使其易于排出體外或者被相關(guān)代謝酶類分解［1－3］。由此可見(jiàn)，生物體遇到逆境時(shí)，GSTs可發(fā)揮脫毒與抗氧化的功能［4］。因此，GSTs與昆蟲代謝抗性具有一定的相關(guān)性，即昆蟲體內(nèi)解毒酶的解毒能力增強(qiáng)是產(chǎn)生抗性的原因之一［5］。

本研究以家蠶耐氟品種和敏感品種為材料，通過(guò)人工添食NaF得到不同中毒程度的家蠶幼蟲，測(cè)定2種家蠶品種體內(nèi)血液與中腸組織中蛋白質(zhì)及GSTs酶活力的差別，找出氟化物對(duì)家蠶蛋白質(zhì)及GSTs的影響，為探明家蠶耐氟機(jī)理及氟化物對(duì)鱗翅目昆蟲的毒害機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試家蠶品種:耐氟品種T6、敏感品種734，均由西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶生物育種實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑:考馬斯亮藍(lán)G－250(Coomassie brilliant blue G－250)為上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，谷胱甘肽－S轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒為南京建成生物工程有限公司產(chǎn)品?？捡R斯亮藍(lán)G－250的配制:稱取10 mg考馬斯亮藍(lán)G－250，溶于5 mL 95%的乙醇中，加入85%(v/v)的磷酸10 mL，最后用蒸餾水定容到100 mL，置于4℃的冰箱中保存;pH=7的磷酸緩沖液的配制:按磷酸氫二鈉∶磷酸二氫鈉=61∶39的體積比配成。1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的配制:準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白，溶于10 mL的蒸餾水中。

主要試驗(yàn)儀器:酶標(biāo)儀，由BIO－RAD公司生產(chǎn);T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，由北京普析通用有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品制備 供試耐氟品種T6、敏感品種734的家蠶，4齡前按普通飼育條件飼養(yǎng)［6］，5齡起蠶時(shí)數(shù)蠶分區(qū)，每個(gè)蠶品種各分為4區(qū)，每區(qū)400頭蠶，試驗(yàn)區(qū)分別使用涂了0(對(duì)照)、50、100、200 mg/kg NaF溶液的桑葉飼育，每天喂3次，以添食24 h后為梯度，一直添食至第7天;分別于5齡第1天至第6天，從各處理組中隨機(jī)選取10頭家蠶，取血液和中腸制備酶液，于－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 家蠶血液和中腸組織蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)［7］的方法制作蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線;利用考馬斯亮藍(lán)G－250法，測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)含量［7］。分別取PBS稀釋10倍的血液和中腸組織的酶液0.02 mL，加入1 mL考馬亮藍(lán)G250，25℃水浴2 min，在酸標(biāo)儀中595下測(cè)OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出家蠶體內(nèi)血液和中腸組織蛋白質(zhì)含量(μgpro·insect)。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 家蠶血液GSTs酶活力的測(cè)定 參照南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶試劑盒說(shuō)明書。將基質(zhì)液、家蠶血液于測(cè)定管中混勻后37℃水浴30 min，然后加入試劑2與家蠶血液，離心后進(jìn)行顯色反應(yīng)。

單位定義:規(guī)定每毫升血清在37℃反應(yīng)1 min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽(GSH)濃度降低1 umol/L為1個(gè)酶活力單位。

1.2.4 家蠶中腸組織GSTs酶活力的測(cè)定 試驗(yàn)方法同 1.2.3。

單位定義:規(guī)定每毫克中腸組織蛋白，在37℃反應(yīng)1 min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶血液中蛋白質(zhì)含量的變化

由試驗(yàn)結(jié)果(表 1)可知，當(dāng) NaF的濃度為50 mg/kg時(shí)，敏感品種734與耐氟品種T6家蠶血液中蛋白質(zhì)的含量無(wú)明顯差異;當(dāng)濃度高于50 mg/kg時(shí)，耐氟品種T6家蠶血液中蛋白質(zhì)的含量高于敏感品種734家蠶血液中蛋白質(zhì)的含量，這可能與其均有較高的耐氟化物特性有關(guān)。

表1 添食不同濃度NaF對(duì)不同品種5齡家蠶血液蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 家蠶中腸組織蛋白質(zhì)含量的變化

敏感品種734與耐氟品種T6各處理區(qū)與對(duì)照區(qū)的家蠶中腸組織蛋白質(zhì)的含量無(wú)明顯差異;隨著添氟天數(shù)的增加，中腸組織蛋白質(zhì)的含量出現(xiàn)上下波動(dòng)，但波動(dòng)的幅度較小，表明氟化物對(duì)家蠶中腸組織蛋白質(zhì)的含量沒(méi)有明顯影響(表2)。

表2 添食不同濃度NaF對(duì)不同品種5齡家蠶中腸組織蛋白質(zhì)含量的影響

2.3 家蠶血液中GSTs酶活力的變化

2.3.1 敏感品種734家蠶血液中GSTs酶活力的變化 敏 感品種734的5齡家蠶添食NaF后血液中GSTs酶活力變化如圖2所示。當(dāng)NaF的濃度為50 mg/kg時(shí)，血液GSTs酶活力接近對(duì)照組，且變化趨勢(shì)相近;添氟濃度高于50 mg/kg時(shí)，與對(duì)照組相比GSTs酶活力出現(xiàn)上下波動(dòng)，變化趨勢(shì)差異較明顯，表明家蠶正常生理活動(dòng)出現(xiàn)紊亂，出現(xiàn)氟中毒的跡象。到5齡第6天時(shí)，隨著添氟濃度的增加血液中GSTs酶活力逐漸地減少。

圖2 添食NaF對(duì)敏感品種734家蠶血液GSTs酶活力的影響

2.3.2 耐氟品種T6家蠶血液中GSTs酶活力的變化 耐氟品種T6的5齡家蠶添食NaF后血液中GSTs酶活力變化規(guī)律較為明顯，添氟組的血液中GSTs酶活力值基本高于對(duì)照組，且隨著添氟濃度的增大，其GSTs酶活力值隨之變大(圖3);由此可知，氟化物可誘導(dǎo)耐氟品種T6血液中GSTs的合成。到5齡第6天，試驗(yàn)區(qū)與對(duì)照區(qū)GSTs酶活力差別不大。比較圖2與圖3可以看出，隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加，在相同添氟濃度下，T6的5齡家蠶血液中GSTs酶活力隨著氟濃度增高而成上升趨勢(shì)，而敏感品種734則出現(xiàn)上下波動(dòng);耐氟品種T6的血液中的GSTs酶活力大于敏感品種734。

圖3 添食NaF對(duì)耐氟品種T6家蠶血液GSTs酶活力的影響

2.4 家蠶中腸組織GSTs酶活力情況

2.4.1 敏感品種734家蠶中腸組織GSTs酶活力情況 敏感品種734的5齡家蠶添食NaF后家蠶中腸組織GSTs酶活力變化如圖4所示。當(dāng)NaF的濃度為50 mg/kg時(shí)，隨著添氟天數(shù)的增加，家蠶中腸組織GSTs酶活力值接近對(duì)照組;當(dāng)添氟濃度大于50 mg/kg時(shí)，隨著添氟天數(shù)的增加，家蠶中腸組織GSTs酶活力值出現(xiàn)較大的波動(dòng)。這表明添氟濃度為50 mg/kg時(shí)，敏感品種734正常的生理活動(dòng)開(kāi)始受到影響，隨著添氟天數(shù)的增加，影響變大。

圖4 添食NaF對(duì)敏感品種734家蠶中腸組織GSTs酶活力的影響

2.4.2 耐氟品種T6家蠶中腸組織GSTs酶活力情況 耐氟品種T6的5齡家蠶添食NaF后中腸組織GSTs酶活力變化如圖5所示。當(dāng)添氟濃度為200 mg/kg時(shí)，隨著添食天數(shù)的增加，耐氟品種T6家蠶中腸組織GSTs酶活力均低于對(duì)照組，GSTs酶活力呈現(xiàn)下降的趨勢(shì);當(dāng)添氟濃度低于200 mg/kg時(shí)，添氟組家蠶中腸組織GSTs酶活力接近或高于對(duì)照組，說(shuō)明添氟濃度為200 mg/kg時(shí)，耐氟品種T6家蠶的正常生理活動(dòng)受到影響。到5齡第6天時(shí)，隨著添氟濃度的增加中腸組織GSTs酶活力逐漸減少。對(duì)比圖4和圖5可知，隨著5齡家蠶添氟天數(shù)的增加，耐氟品種T6各添氟組家蠶中腸組織GSTs酶活力波動(dòng)的幅度較小，而敏感品種734各添氟組中腸組織GSTs酶活力波動(dòng)的幅度較大。

圖5 添食NaF對(duì)耐氟品種T6家蠶中腸組織GSTs酶活力的影響

3 討論

耐氟品種T6與敏感品種734血液與中腸組織蛋白質(zhì)的含量，隨著添氟天數(shù)和濃度的增加，都未見(jiàn)明顯的變化，因此推測(cè)氟化物對(duì)家蠶體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量影響較小;但耐氟品種T6家蠶的血液中GSTs酶活力的變化有一定的規(guī)律性，隨著添氟天數(shù)和濃度的增加，其血液中的GSTs酶活力也相應(yīng)增加，而其中腸組織GSTs酶活力波動(dòng)的幅度較小，表明氟化物對(duì)蠶血液的毒害作用比中腸低。

敏感品種734各添氟組蠶的血液及中腸組織GSTs酶活力變化無(wú)明顯規(guī)律，隨著添氟天數(shù)和濃度的增加，其GSTs酶活力值出現(xiàn)較大幅度的波動(dòng)，但最終呈下降趨勢(shì)。這表明氟對(duì)敏感品種734中腸及血液的毒害均較大。有研究結(jié)果表明，對(duì)天然的有毒物質(zhì)、工業(yè)污染及化學(xué)農(nóng)藥具有抗性的昆蟲，體內(nèi)的GSTs酶含量通常都比無(wú)抗性的昆蟲高［8］，說(shuō)明昆蟲體內(nèi)GSTs活性的升高是產(chǎn)生抗性的重要原因之一。因此，推測(cè)家蠶對(duì)氟化物的抗性可能與體內(nèi)GSTs酶活力的高低有關(guān)。

從耐氟品種T6中腸組織的GSTs酶活力變化可以看出，在一定范圍內(nèi)，氟化物能夠促進(jìn)家蠶體內(nèi)GSTs酶含量的增加。由于GSTs基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為GSTs酶，由此推測(cè)，一定濃度范圍內(nèi)的氟化物，可能會(huì)引起GSTs酶相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)［9］。如果這一推測(cè)成立，就意味著GSTs基因以表達(dá)量的增加維持體內(nèi)GSTs酶的正常水平及功能，從而形成抗性。這一推測(cè)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

耐氟品種T6的氟化物抗性較高但經(jīng)濟(jì)性狀較差，敏感品種734具有良好的經(jīng)濟(jì)性狀卻不耐氟;因此，如將T6的氟化物抗性基因?qū)朊舾衅贩N734中，使734成為具有良好經(jīng)濟(jì)性狀的抗氟化物蠶品種是今后的研究方向。

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S881.2

A

1007－0982(2014)02－0008－05

2013－12－19;

2014－01－13

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(編號(hào)CARS－22)。

李冬兵(1988—)，男，云南曲靖，本科，助理農(nóng)藝師。

Tel:0831－6256573，E-mail:ldbing123@126.com

劉學(xué)鋒(1963—)，男，四川宜賓，本科，高級(jí)農(nóng)藝師。

Tel:0831－6256573，E-mail:yibinshiyongjun@163.com