鐘麗娟，趙新海，池景良，張慶華，朱巍巍，關(guān)艷麗

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000)

利用原生質(zhì)體進行微生物遺傳育種是近幾十年來迅速發(fā)展的一種育種技術(shù)，其基本實驗方法已較成熟，主要集中在原生質(zhì)體制備及再生、紫外及化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合與轉(zhuǎn)化等方面。應(yīng)用原生質(zhì)體誘變技術(shù)改造微生物菌種在實踐中取得了顯著成果，例如通過原生質(zhì)體紫外誘變提高相關(guān)菌種產(chǎn)紫杉醇、蘇云金毒素、谷胱甘肽、α-淀粉酶等微生物代謝產(chǎn)物的能力［1］。作者對秸稈生物降解產(chǎn)品的生產(chǎn)菌株10768進行原生質(zhì)體紫外誘變，比較了突變菌株的剛果紅透明圈大小和纖維素酶活力，旨在篩選出高產(chǎn)纖維素酶的菌株，為下一步菌種選育及菌株改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

LCCC10768由遼寧省微生物菌種保藏中心提供，該菌株為遼寧省微生物科學(xué)研究院自主研發(fā)的秸稈生物降解菌種，產(chǎn)品已獲得農(nóng)業(yè)部微生物肥臨時登記證 (2011臨字1374號)。

1.2 原生質(zhì)體制備

取進入對數(shù)生長期的菌種以1%的接種量轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 h后，加入4 U·mL-1青霉素鈉溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，3000 r·min-1離心10min收集菌體，用高滲磷酸緩沖液洗滌2次，調(diào)整菌體濃度至108個·mL-1，吸取菌液 10mL，3000 r·min-1離心5min，加入5mL溶菌酶緩慢混合均勻，置于37℃溫水浴中保溫酶解，每隔30min取樣鏡檢，至大部分菌體破壁，釋放出原生質(zhì)體即停止酶解。酶解結(jié)束后，3000 r·min-1離心10min，用高滲磷酸緩沖液洗滌2次以清除酶液，將原生質(zhì)體重新懸浮于滲透壓穩(wěn)定液SMM中［2］，用血球計數(shù)板計數(shù)，計算原生質(zhì)體形成率［3-6］。

1.3 原生質(zhì)體紫外誘變

將制備好的原生質(zhì)體用SMM稀釋至106mL-1，取5mL于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，調(diào)整距離為30 cm，紫外燈照射劑量分別為30 s，60 s和120 s，照射的同時進行磁力攪拌［7］。

1.4 原生質(zhì)體再生

在暗室條件下，將經(jīng)過紫外誘變的原生質(zhì)體分別用SMM和無菌水進行梯度稀釋，輕輕吸放于DM3琥珀酸鈉再生培養(yǎng)基［8］上 (下層加入2%瓊脂，上層加入0.5%瓊脂，提前一天倒好再生培養(yǎng)基的下層，以使表面干燥)，緩慢倒入培養(yǎng)基上層，混合均勻，每處理重復(fù)3次，放置于紙箱中避光，30℃恒溫培養(yǎng)。將未進行紫外誘變的原生質(zhì)體用SMM稀釋后吸放于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3次重復(fù)，用于計算紫外致死率。

其中，A為未誘變的原生質(zhì)體再生菌落數(shù)，B為SMM稀釋的紫外誘變原生質(zhì)體菌落數(shù)。

其中，B為SMM稀釋后再生菌落數(shù)，C為水稀釋后生長菌落數(shù)，D為血球計數(shù)器法測得的原生質(zhì)體數(shù)。

將經(jīng)過紫外照射60 s，將DM3培養(yǎng)基上生長出的菌落挑至LB平板培養(yǎng)基上，劃線純化保存。

1.5 剛果紅透明圈法初篩

將突變菌株點接至CMC-Na培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，用游標卡尺測定菌落直徑后，倒入10mg·mL-1剛果紅染色1 h后，用1 mol·L-1NaCl溶液沖洗，測定透明圈直徑。

1.6 突變菌株液體產(chǎn)酶活力測定

將供試液體菌株以2%接種至秸稈粉培養(yǎng)基中，30℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)120 h后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)于7000 r·min-14℃條件下離心10min，上清液即為粗酶液。產(chǎn)酶活力測定方法參照吳紅艷等［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變劑量對菌株10768原生質(zhì)體致死率的影響

不同紫外誘變劑量對10768原生質(zhì)體致死率的影響見表1，隨著誘變劑量增加，致死率升高，據(jù)文獻報道，致死率在70%～80%時存活菌變異現(xiàn)象顯著，正突變率高，誘變效果好。因此選擇10768原生質(zhì)體的紫外誘變劑量為60 s。

表1 紫外誘變劑量對原生質(zhì)體致死率及再生率的影響

2.2 突變菌株剛果紅透明圈法初篩結(jié)果

利用紫外突變，共分離出97株菌株，分別點接至CMC-Na培養(yǎng)基上，其中11株透明圈較大，其透明圈直徑/菌落直徑均大于原始菌株，測定結(jié)果見表2。UV09，UV14和UV22的比值較大，選擇這3個菌株為優(yōu)良突變株進行纖維素酶酶活的測定。

表2 原生質(zhì)體再生突變株剛果紅透明圈法測定結(jié)果

2.3 突變菌株液體培養(yǎng)物纖維素酶活測定結(jié)果

供試的3株突變菌株的纖維素酶活力測定結(jié)果見表3。透明圈大的突變株，其在液體培養(yǎng)基中纖維素酶活也高，其中UV22的纖維素酶活較原始菌株提高了51%。

表3 突變菌株固體培養(yǎng)物纖維素酶活測定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本文主要研究了秸稈生物降解菌株10768的原生質(zhì)體紫外誘變劑量及其突變株纖維素酶活力。雖然原生質(zhì)體制備的試驗技術(shù)已相當成熟，但不同菌株生理特性各異，原生質(zhì)體制備條件不盡相同，本研究在原生質(zhì)體制備中加入了4 U·mL-1青霉素，縮短了試驗周期;所獲得的97株突變株有3株透明圈直徑/菌落直徑的比值大于4.38，纖維素酶活力較原始菌株提高30%以上，尤其是UV22的纖維素酶活力增加了50.90%。本試驗結(jié)果表明原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)是進行菌種選育的有效手段，后續(xù)還將開展突變菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性的研究。隨著原生質(zhì)體技術(shù)的發(fā)展，微生物的原生質(zhì)體融合及轉(zhuǎn)化技術(shù)也已日漸成熟［10］，融合2株乃至多株菌株從而獲得多個優(yōu)良性狀的生產(chǎn)菌種是微生物菌種選育今后的努力方向。

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