陸燕春　韓素英

【摘要】 通過將熒光標記的骨髓間充質干細胞移植入治療組大白鼠機體內，通過觀察，確定植物源性生肌因子對于心肌梗塞的治療效果。在本研究中，首先對于心肌梗塞基本情況進行了描述，并針對當前存在的治療方法及弊端進行了探討；其次對植物性生肌因子治療有效性給出了總結，其中包括有效成分的制備、實驗假設與期望；最后，從形態(tài)學評估、心肌梗死體積有效評估和熒光標記追蹤來分析植物源性生肌分子的誘導分化機理。

【關鍵詞】 植物源性生肌因子；心肌梗塞

心肌梗塞為缺血性心臟病的主要種類之一，在當前醫(yī)學界，尚無任何治療手段和藥物能夠有效治療心肌梗塞，多種先進的治療方法，如冠狀動脈支架及旁路移植等只是對心肌梗塞起到緩解作用而不能根治。根據相關研究可知，通過引入外源干細胞或內源性祖細胞庫的方法，再生細胞便能夠取代死亡心肌細胞，使心肌梗塞得以根本性治療，然而這一方案的效率很低難以具體實施[1]。在之前研究的基礎上，我們在柔毛水楊梅中獲取了甲醇提取物，此種物質對于心肌細胞的再生具有促進作用，為心肌梗塞的治療指明方向。

1 心肌梗塞基本概況

心肌梗塞指的是當心臟中某一部分血流供應中斷所造成的心肌組織缺血壞死。通常，冠狀動脈的粥樣硬化斑塊被損傷而破裂是導致血液供應中斷的主要誘因[2]。盡管大多數的心肌梗塞都表現出如胸骨后部疼痛并輻射至背部和頸部、呼吸困難、焦慮出汗、突發(fā)性胸悶等，然而相當一部分的患者在無明顯病癥的情況下便發(fā)生突發(fā)性心肌梗塞[3]。一般來說，上述癥狀在數分鐘內會呈現出逐漸發(fā)作的特點。其中，急性心肌梗塞常表現為胸悶，多被發(fā)作者描述成緊張感；其他癥狀如惡心、出汗、心悸等主要由機體內交感神經的過分緊張而導致，此時身體中血流動力學突然改變、身體疼痛等都會帶來兒茶酚的激增，發(fā)生心肌梗塞的重癥病例患者會突然死亡或喪失意識。

2 目前治療心肌梗塞方法及療效

為了能夠達到對心肌梗塞修復的目的，眾多醫(yī)學專家試圖尋找能夠促使心肌細胞發(fā)生再生的干細胞，如ESC、HSC、成肌細胞[4]等，但用這些祖細胞誘導心肌細胞分化效果不太理想。另有通過誘導多功能干細胞的方法來達到細胞治療目的等方法，但由于亟待解決的問題尚多（如，如何進行外源基因表達控制及維持細胞治療穩(wěn)定性），因此還不能應用。

3 植物提取物有效成分對于心肌梗塞治療的有效性判斷

3.1 植物提取物的制備 最近我們發(fā)現，利用有機溶劑對柔毛水揚梅進行提取能夠獲得EGJ，這種物質對于促進骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化具有重要意義[5]，同時能夠顯著治療心肌梗塞，另外，相關研究已經明確給出了EGJ對于促進心肌細胞再生的機理和證據[6]。在本課題中，我們通過將離心法和活性導向法有機結合，將EGJ活性化合物提取出來，經過分離的EGJ仍能夠對于心肌細胞的分化起到促進作用。

在本研究中，離心法和活性導向法對于藥物促進骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化程度具有評價作用，同時能夠對藥物的活性起到檢測作用，并未下步分離作指導。在反復分離之后，治療心肌梗塞有效成分（植物源性生肌分子）便能夠從柔毛水楊酸甲醇提取物當中得到分離。經HPLC分析可知，分離純度在96%之上，且經核磁共振能夠明確所提取升生肌因子的化學結構。

3.2 利用植物源性生肌分子進行心肌梗塞治療的假設及期望

首先，我們試圖研制出一種易于在臨床應用中推廣，安全系數高的口服治療心肌梗塞的方法，此種方法能夠取代過去極具危險性和侵入性的局部注射方法。

其次，在植物源性因子誘導心肌再生的過程中，我們將骨髓間充質干細胞認為是來源，并在接下來的研究中試圖證明這一點。

最后，我們假設，在機體發(fā)生心肌梗塞之后，骨髓間充質干細胞移動到了梗塞部位，并在植物源性因子的誘導下，將特定的基因激活、表達，引導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化。

4 植物源性生肌分子對于心肌梗塞治療作用

4.1 形態(tài)學評估 可以對心臟斷面圖進行評估、檢查。利用福爾馬林對實驗心臟標本固定好，采用平面評估計算法對心臟的大體狀況進行評價。首先，通過肉眼對所選對比組大白鼠心臟進行觀察，能夠觀察到遠端約有3-5mm直徑的凹陷不平、灰白色梗死區(qū)域。而與之形成對比的是，治療組大白鼠的心肌梗死區(qū)域出現瘢痕范圍比對比組小1/2左右，治療效果存在顯著性差異。其次，將心臟依其短軸并經梗死區(qū)縱切，可以看到對照組的大白鼠心臟梗死區(qū)心室壁比治療組薄，治療效果差異性顯著。將切片置于低倍顯微鏡下觀察可發(fā)現，對比組的心肌梗死區(qū)域存在相當多的纖維瘢痕，由于這些纖維瘢痕的存在，而導致當對切片進行Masson染色后，表面呈現藍色；相比之下，治療組的心肌梗死區(qū)域則存在很多嗜伊紅細胞的集落，且經Masson染色后，藍色明顯減少，表明治療效果顯著。

4.2 對心肌梗死體積有效評估 對大白鼠梗死心肌區(qū)域進行形態(tài)學度量，進而定量分析其心肌梗死的體積，將平均梗死的體積用與左心室體積相比的百分數進行表示。實驗結果表明，經植物源性生肌分子治療三周后的大白鼠機體內心肌梗死的體積百分數明顯降低（n=10，18.5±3.6%），而對比組的大白鼠機體內心肌梗死的體積百分數則高于治療組（n=10，32.2±4.3%），表明治療效果存在統(tǒng)計學差異。通過顯微鏡可以觀察到，對比組中心肌細胞梗死區(qū)呈現出顯著的藍色瘢痕纖維。而經植物源性生肌分子治療組則存在較多心肌細胞團。另外，經對比發(fā)現，梗死區(qū)心肌細胞體積較?。s小1/3）。這些觀察結果表明，存在的心肌細胞屬于再生的心肌細胞，且經過攢聚而形成心肌組織，對于梗死區(qū)域來說起到了修復和更新的作用。

為進一步判斷存在的心肌細胞是否經再生得出，實驗小組利用肌球蛋白重鏈抗體與心肌細胞的抗原免疫來實行染色操作，在所得結果中，我們能夠找到經特異性陽性染色（Ki67）的心肌細胞細胞核，此項實驗結果證實了所得細胞為再生細胞，這些細胞的細胞漿經肌球蛋白重鏈陽性染色，這說明再生細胞為心肌細胞。

綜上所述，分布于大白鼠梗塞區(qū)心肌細胞為再生性心肌細胞，而植物源性生肌分子治療對于修復、治療被損傷的心肌細胞效果顯著。

4.3 利用熒光標記對植物源性生肌分子誘導分化機理進行追蹤 由于在之前我們提到了實驗假設，即在機體發(fā)生心肌梗塞之后，骨髓間充質干細胞移動到了梗塞部位，進而引導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化。為了證明這一假設，實驗小組通過對骨髓間充質干細胞進行熒光DiI標記，并將經過處理的細胞向治療組大白鼠機體的骨髓中移植，以此形成對熒光標記細胞的追蹤。緊接著，實驗小組將移植了熒光標記細胞的骨髓造成心肌細胞模型，并對其進行植物源性生肌分子治療。經為期3周的治療，將治療組大白鼠心臟活體取出，并固定，以石蠟進行包埋，然后切片，借助于熒光顯微鏡對特異性熒光染色進行觀察。通過觀察可以發(fā)現，治療時間達1周或3周，在整個心肌梗塞區(qū)可以觀測到DiI熒光標記陽性細胞及新生成的血管。在對照組大白鼠心臟梗塞區(qū)內，只有叫少量陽性DiI細胞稀疏分布在梗塞區(qū)邊緣。另外，經植物源性生肌分子治療的心臟梗塞區(qū)中，能夠觀察到很多陽性染色細胞核，且其中，有很多為細胞漿陽性DiI心肌細胞核。這些都是骨髓間充質干細胞移動到了梗塞部位，進而引導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化的有力證據。對治療組大白鼠進行3周植物源性生肌分子治療后，心肌細胞體積明顯較前1周、2周有所增大，這表明，再生心肌細胞能夠伴隨時間增長而逐步發(fā)育成熟。

5 結束語

本實驗通過對柔毛水揚梅中EGJ成分進行提取，證實了植物性生肌分子對于心肌細胞分化的促進作用，能夠有效引導心肌細胞再生，對于心肌梗塞的治療具有重要意義。由于口服植物性生肌分子的降低心肌梗塞藥物風險、提高治療有效度、取代心肌注射操作等尚在設想、研發(fā)階段，因此本研究為相關工作指明了前進方向?？梢钥隙ǖ氖?，植物源性生肌因子的方法對于心肌梗塞治療相關研究來說，是一個巨大進步，但目前需要做的是通過更多改進將其推廣到臨床應用上。在下一步的工作當中，我們將對植物性生肌因子在機體內的藥代動力學、藥效學和詳細代謝影響做系統(tǒng)性研究，并且在其優(yōu)越修復機制的特點上，試圖將其進一步應用于慢性缺血性心臟病及陳舊性心肌梗塞上。

參考文獻

[1] 孫燕燕，楊樹標，路巍.治療急性心肌梗塞泵衰竭40例療效觀察[J].齊魯醫(yī)學雜志，2010，（04）.

[2] 張承宗，鄭成環(huán)，趙文鼎，傅文棟，李廣平，金曉靜，蔡金榮，李立豐，劉洪梅.心肌梗塞患者長期應用美多心安隨訪結果[J].中國康復醫(yī)學雜志，2011，（06）.

[3] 楊回珍，劉家嫻，李佛庭.心肌梗塞和心肌缺血特征對比分析[A].第二屆全國心功能學術研討會論文摘要匯編[C].2010.