許穎，王丹，石嬌，周曉萍，王建，常曉松

（1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，成都 610500；2.四川出入境檢驗檢疫局，成都 610041）

近年來，隨著載人航天的發(fā)展、核電設(shè)施的建設(shè)以及核技術(shù)在軍事、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療中的應(yīng)用普及，電離輻射作為一種不可避免的脅迫因素大量存在于人類工作和生活環(huán)境之中。尤其是如航天員、核電站工作人員、從事核相關(guān)醫(yī)療從業(yè)人員和腫瘤患者，暴露于輻射的機會較多，接受的累積輻射劑量也更大。因此，電離輻射防護(hù)和輻射病的診療顯得尤為重要［1］。

課題組前期構(gòu)建了基于嗜肺軍團(tuán)菌鞭毛蛋白的重組蛋白FlaA N／C，輻照實驗表明，其在2h時相點預(yù)防性皮下注射的小鼠具有良好的輻射防護(hù)能力（專利申請?zhí)枺?01410075339.8）。鞭毛蛋白作為PAMP的一種，是目前為止發(fā)現(xiàn)的TLR5唯一配體，TLR5與鞭毛蛋白結(jié)合后，介導(dǎo)一系列炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如 CTL、IL－8、G－CSF、IL－6、TNFα、SOD－2和IP－10等細(xì)胞效應(yīng)因子。CBLB502的研究結(jié)果［2］提示，該輻射抗性作用途徑為TLR5依賴的，通過NF－κB的激活產(chǎn)生大量的輻射保護(hù)因子（如G－CSF和IL－6等）所致。目前，鞭毛蛋白介導(dǎo)的輻射防護(hù)機制研究主要集中在基因組水平和蛋白水平，但其是否為輻射防護(hù)的唯一途徑尚有待進(jìn)一步研究，其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制尚未開展。據(jù)此，課題組擬開展miRNA基因芯片研究，為FlaA N／C蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

RNA質(zhì)檢時的分光光度計采用NanoDrop?ND－1000（Thermo Scientific，DE，USA）；RNA 質(zhì)檢時的安捷倫生物分析儀采用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies Genomics，CA，USA），芯片檢測采用Agilent RNA 6000Nano Kit（Cat ＃ 5067－1511， Agilent Technologies Genomics，CA，USA）；芯片雜交使用控溫雜交培養(yǎng)箱：Hybridization Shaking Oven （ OH－800D，Yihder，Taiwan）；芯片熒光掃描儀采用 Axon 4000B（Molecular Devices，CA，USA）。

1.2 動物實驗

將8～10w齡雄性BALB／C小鼠10只分為兩組：FlaA N／C組和空白對照組，每組5只。FlaA N／C組皮下注射FlaA N／C蛋白1μL／mg，2h后乙醚麻醉，采集小鼠小腸全段組織，用生理鹽水洗凈血液等雜物，液氮速凍。

1.3 RNA Extraction／RNA提取

取體積100μL凍存組織（每只小鼠各取等量組織混合），加1mL TRIzol reagent（Invitrogen Cat＃15596－026）及200mg 1.5mm mini－beads加入2 mL EP管中，以 mini－beadbeater（最大轉(zhuǎn)速，15s，置冰上3min）重復(fù)擊打4次，抽提過程全部保存于4℃，12 000g，4℃ 離心10min，去除沉淀及脂肪層后，室溫靜置5min將組織完全裂解，加入200 μL BCP，震蕩15s，室溫靜置3min后，12 000g，4℃離心15min，取上清液500μL置于新管。加入2 μL（10μg）glycogen，上下反轉(zhuǎn)3次混勻后，加入500μL 100%isopropanol再次上下反轉(zhuǎn)3次直至勻相。靜置室溫10min沉淀，將沉淀物以80% 乙醇清洗兩次后，加入30μL RNase－free ddH2O回溶。

1.4 Microarray Analysis／miRNA基因芯片分析

2.5 μg 總 RNA 通 過 NanoSep100K （pall corporation，USA）管柱富集出小RNA（＜200bp）片段，并通過 Vivaspin500 3K（sartorius stedim biotech）管柱脫鹽后，利用ULSTM Labeling Kit（kreatech diagnostics，the Netherlands）試劑盒進(jìn)行Cy5熒光標(biāo)定。標(biāo)定完成的小RNA雜交于已經(jīng)過預(yù)雜交的Mouse miRNA OneArray v5芯片（phalanx biotech group，Hsinchu，Taiwan），雜交環(huán)境37℃，16h；清洗 WashI 37℃－5min，WashII 37℃－5min，WashIII 20次。芯片以離心方式甩干后，使用Axon 4000B熒光掃描儀進(jìn)行訊號讀取，并以GenePix 4.1軟件 （molecular devices）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

芯片數(shù)據(jù)以R套組進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選、均一化及統(tǒng)計計算。去除在所有芯片flag＜0的探針，將同一探針重復(fù)的數(shù)據(jù)取中位數(shù)值，后以invariant set normalization方法進(jìn)行樣本間數(shù)據(jù)均一化，并以pair－wise T－test方法計算兩兩比對樣本或組別間的差異倍數(shù)及P值。差異基因篩選條件設(shè)定為｜log2ratio｜≥0.8，P＜0.05。

1.5 差異miRNA生物信息學(xué)分析

針對差異的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測及通路分析，采用miRNA靶基因預(yù)測及通路分析網(wǎng)站工具 miRSystem （http：／／mirsystem.cgm.ntu.edu.tw／index.php），整 合 7 個 靶 基 因 預(yù) 測 網(wǎng) 站（DIANA、miRanda、miRBridge、PicTar、PITA、rna22和TargetScan）及2個靶基因?qū)嵶C數(shù)據(jù)庫（TarBase和miRecords），以至少4個網(wǎng)站均預(yù)測到靶基因為挑選原則進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 miRNA芯片圖譜及結(jié)果分析

在FlaA N／C皮下注射后2h，取小鼠腸組織進(jìn)行miRNA的芯片研究，結(jié)果顯示，有108個miRNA上調(diào)，59個miRNA下調(diào)（見圖1）。

圖1 FlaA N／C蛋白刺激小鼠腸組織miRNA芯片結(jié)果

2.2 生物信息學(xué)分析

經(jīng)過生物信息學(xué)軟件分析，通過對PUBMED收錄的miRNA文獻(xiàn)進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)，差異miRNA 預(yù)測靶點主要集中在 NF－κB、PI3K－Akt、p53和Caspase等信號通路，miRNA以上調(diào)居多，靶 點 主 要 位 于 TNF－α、TNF－R1、IL－1、NGF／CASP3／Bcl－2／XL、IRAK1／2、IKK／IAP、PI3K、Akt／PKB、PKA和 Bcl－2，其余 miRNA 靶點還涉及WNT、VEGF和NOTCH等信號通路（見表1）。

表1 NF－κB、PI3K－Akt、p53和Caspase等信號通路相關(guān)差異miRNA與預(yù)測靶蛋白

3 討論

miRNA是一類約22～25個堿基的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶基因mRNA的3＇UTR結(jié)合抑制蛋白翻譯。據(jù)推測，可編碼蛋白的基因大約有60%受 miRNA 調(diào) 控［3，4］，一 些 具 有 特 異 功 能 的miRNA已被報道［5，6］。miRNA和信號通路在機體行使功能中具有重要作用，信號通路可調(diào)控miRNA轉(zhuǎn)錄、加工成熟和功能發(fā)揮，同時miRNA可調(diào)節(jié)信號通路的信號級聯(lián)放大、信號通路之間的cross－talk和信號網(wǎng)絡(luò)魯棒性［7］。因此，研究miRNA網(wǎng)絡(luò)與信號通路的相互調(diào)控在FlaA N／C介導(dǎo)輻射防護(hù)中的作用，將有助于深刻理解輻射和生物學(xué)效應(yīng)的分子機制，從而為開發(fā)有效的輻射防護(hù)方法提供理論支持，并可為臨床放療提供可能的分子生物學(xué)治療手段。

鑒于輻射防護(hù)在軍事、醫(yī)療等領(lǐng)域的重要性日益凸顯，近年來輻射防護(hù)相關(guān)研究逐步受到關(guān)注。對輻射防護(hù)相關(guān)miRNA的研究［8，9］表明，人和鼠正常細(xì)胞、癌細(xì)胞、腫瘤組織在輻照后miRNAs表達(dá)譜均出現(xiàn)改變，同時離子輻射后能夠?qū)е聶C體多種信號途徑的激活，包括P53通路、JNK通路、MAPK級聯(lián)反應(yīng)和 NF－κB激活，以保證宿主抗輻射損傷［10，11］。

本課題針對差異的miRNAs進(jìn)行了靶基因預(yù)測及通路分析，通過對PUBMED收錄的miRNA文獻(xiàn)進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)譜中異常改變非常顯 著 的 miR－21、mmu－let－7 家 族、miR－122、miR－126、miR－146a、miR－181 家 族、miR－200 家 族 和miR－30家族等miRNAs及其預(yù)測靶蛋白主要集中在 NF－κB、PI3K－Akt、p53和Caspase等與凋亡密切相關(guān)的通路。腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase家族蛋白表達(dá)降低或活性減弱是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生輻射耐受性的重要原因之一［12］。抑制 Bcl－2、Bcl－XL表達(dá)能夠增敏癌細(xì)胞輻射抗性［13］，持續(xù)性表達(dá) NF－κB是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抗凋亡的重要原因，同時也是導(dǎo)致腫瘤輻射防護(hù)能力增強的重要機制［2］。Chang等［14］對前列腺癌的研究表明，PI3K／Akt／mTOR通路的激活能夠抑制凋亡，增加前列腺癌細(xì)胞的輻射抗性，Caspase 3的激活能夠降低腫瘤細(xì)胞輻射抗性［15］，p53信號通路的激活也能夠有效增敏輻射抗性［14，16］。

研究［17，18］表明，腫瘤細(xì)胞的抗凋亡機制在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的輻射防護(hù)抗性方面具有重要作用。近年來，圍繞分子靶向抗凋亡蛋白的研究為腫瘤放療提供了 新 的 技 術(shù) 手 段［19，20］，CBLB502 的 研 究［2］表 明，持續(xù)活化的NF－κB通路是引起腫瘤細(xì)胞抗凋亡的的重要原因之一，而且其抗凋亡作用最終介導(dǎo)了小鼠的輻射防護(hù)能力，但其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制尚不清楚，有待進(jìn)一步設(shè)計實驗開展研究。本實驗中PI3KAkt、p53和Caspase等與凋亡密切相關(guān)通路的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步拓展新的輻射防護(hù)機制提供了思路，有必要以凋亡為切入點開展FlaA N／C蛋白介導(dǎo)的腸黏膜上皮細(xì)胞輻射防護(hù)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制研究。

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