楊永長，陳亮，肖代雯，喻華，劉華，黃文芳

（四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，成都 610072）

psm－mec是2009年Queck等在SCCmec上發(fā)現(xiàn)的一種新基因，其位于移動遺傳元件SCCmec（Staphylococcal Cassette Chromosome mec）上，主要存在于院內(nèi)感染相關的SCCmec II和III型葡萄球菌中［1］。研究發(fā)現(xiàn)，psm－mec具有調(diào)控毒力和生物被膜的能力，psm－mec缺陷和psm－mec突變可增加耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的毒力，降低其生物被膜形成能力，在無生物被膜形成能力的表皮葡萄球菌中，導 入psm－mec 可 誘 導 生 物 被 膜 形 成［2－5］。Monecke等［6］發(fā)現(xiàn)psm－mec同樣存在于人葡萄球菌中，人葡萄球菌可在嬰幼兒和免疫抑制患者中引起菌血癥［7－9］。到目前為止，尚未見血液來源人葡萄球菌psm－mec的相關報道。為了探討psm－mec在人葡萄球菌中的功能，本研究首先采用分子生物學技術分析psm－mec在血液分離人葡萄球菌中的分布特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

25株人葡萄球菌來自2011年6月～2013年1月我院臨床分離血培養(yǎng)陽性標本，所有菌株采用VITEK－2COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。

1.2 儀器與試劑

全自動微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK－2 COMPACT，法國生物梅里埃），PCR擴增儀（PTC－200，美國Bio－Rad），Gel Doc XR＋凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio－Rad），SAV－570電泳儀（美國Savant）；PCR反應體系、100bp DNA marker購自北京康為世紀，mecA、psm－mec和SCCmec分型引物由上海invitrogen合成。

1.3 細菌收集和DNA提取

復蘇低溫保存的人葡萄球菌，接種至血平板，37℃5%CO2培養(yǎng)24h，收集細菌，10 000rpm離心5 min，沉淀加40μL DNA提取液，加熱100℃10 min后，10 000rpm離心5min，上清液即為人葡萄球菌DNA。

1.4 PCR擴增人葡萄球菌mecA及psm－mec基因

根據(jù)文獻［1］設計引物，PCR擴增人葡萄球菌的mecA 和psm－mec基因，mecA 引 物 序列為：mecA F 5＇－TCCAGATTACAACTTCACCAGG－3＇，mecA R 5＇－CCACTTCATATCTTGTAACG－3＇ ，PCR產(chǎn)物長度為527bp。反應體系：2×Taq Master Mix 5μL，上下游引物各0.25μL，DNA 1.5 μL，DH2O 3μL。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5mim。psm－mec引物序列為：psm－mec F 5＇－CGAAAGCCTGAAT GCAAGTCT－3＇psm－mec R 5＇－GGATTTCACTGGTGTTAT TACAAGC－3＇PCR擴增產(chǎn)物長度為130bp。反應體系：2×Taq Master Mix 5μL，上下游引物各0.25 μL，DNA 1.5μL，DH2O 3μL。反應條件：95℃預變性3min，95℃變性30s，42℃退火30s，72℃延伸30s，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸5mim。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后Bio－Rad凝膠成像儀檢測。

1.5 多重PCR檢測耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec型別

根據(jù)文獻［10］設計引物，SCCmec擴增位點，引物序列和產(chǎn)物大小如表1所示。配制200nmol／L引物 KDP F1／R1、RIF4F3／R9為 M1；800nmol／L的引物DCS F2／R1、MECI P2／P3、IS431P4為 M2；400nmol的引物CIF2F2／R2、MECI P2／P3、RIF5 F10／R13、pUB110R1、pT181R為 M3。反應體系：2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 6μL，引物 M1 0.5μL、M2 0.5μL、M3 1μL，DNA 2μL。反應條件：94℃預變性4min，94℃30s，72℃30s，50℃30s，72 ℃ 1min，30個循環(huán)，72 ℃延伸4min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后Bio－Rad凝膠成像儀檢測。

表1 人葡萄球菌SCCmec擴增位點，引物序列和片段大小

2 結果

2.1 PCR擴增mecA和psm－mec基因的檢測結果

PCR凝膠電泳結果如圖1所示，25株血液分離的人葡萄球菌中，mecA陽性菌株占84%（21／25），mecA陰性菌株占16%（4／25）。在10株mecA陽性人葡萄球菌中檢測到psm－mec基因，其余15株人葡萄球菌未檢測到psm－mec基因。

2.2 多重PCR檢測人葡萄球菌SCCmec分型

多重PCR凝膠電泳結果如圖2所示，21株耐甲氧西林人葡萄球菌中，3株只擴增出A位點，暫定為SCCmec類I型，1株為SCCmecⅢA型，1株為SCCmecⅢB型，4株擴增出C和E或F位點，暫定為SCCmec類IIIA型，1株只擴增出A和C位點，暫定為SCCmec類IIIB型，3株只擴增出mecA，暫定為SCCmec類Ⅳ，剩下8株無法分型，暫定為SCCmec新型別（見表2）。

2.3 psm－mec在人葡萄球菌SCCmec的分布

分析mecA、psm－mec和SCCmec型別的關系，發(fā)現(xiàn)psm－mec基因主要分布在耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec III、類III型和SCCmec新型別上，其中1株分布于SCCmecⅢA，1株分布于SCCmecⅢB，4株分布于SCCmec類IIIA，1株分布于SCCmec類IIIB，3株分布于SCCmec新型別。而在11株耐甲氧西林人葡萄球菌和（3株SCCmecIV－dcs，3株SCCmec I－dcs，5株SCCmec新型別）4株甲氧西林敏感人葡萄球菌中不存在psm－mec基因（見表3）。

表2 多重PCR檢測耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec型別

表3 psm－mec在人葡萄球菌SCCmec上的分布

圖2 多重PCR擴增SCCmec的凝膠電泳結果

3 討論

人葡萄球菌可感染嬰幼兒和免疫力低下患者，F(xiàn)ajardo Olivares等［11］報道耐甲氧西林人葡萄球菌的分離率在凝固酶陰性葡萄球菌感染患兒中占第二位。Garza－González等［12］研究顯示：臨床分離的人葡萄球菌中，絕大部分都是甲氧西林耐藥株。Mendoza－Olazarán等［13］發(fā)現(xiàn)血培養(yǎng)分離菌株中，81%為攜帶mecA的人葡萄球菌。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)血液來源的84%人葡萄球菌攜帶mecA，與文獻報道基本一致。

甲氧西林耐藥主要與mecA有關，其為編碼低親和力青霉素結合蛋白的外源性DNA以復合體的形式存在于可移動性SCCmec上。SCCmec由mec復合體和染色體盒重組復合體（ccr）兩部分組成，根據(jù)mec和ccr同源性重組不同，可將SCCmec分為不同的類型。文獻報道，絕大多數(shù)臨床分離的耐甲氧西林人葡萄球菌屬于不可分型SCCmec型別。2002年Oliveira等［10］以各型獨特的基因結構為基礎建立的多重PCR是目前應用最為廣泛的SCCmec分型技術，本研究應用Oliveira多重PCR對21株mecA陽性人葡萄球菌分型，結果顯示：1株屬于SCCmec IIIA型，1株屬于SCCmec IIIB型，19株無法分型。在無法分型的SCCmec多重PCR結果中，筆者發(fā)現(xiàn)3株只擴增出pls位點，暫定為SCCmec類I型（SCCmec I－dcs），4株擴增出C和E或F位點，暫定為SCCmec類IIIA型（3株SCCmecIIIA－Tn554／orfX，1株SCCmecIIIA－pI258／Tn544），1株擴增出A和C位點，暫定為SCCmec類IIIB型（SCCmecIIIB＋pls），3株只擴增出mecA，暫定為SCCmec類Ⅳ（SCCmecIV－dcs），剩下8株無法分型，暫定為SCCmec新型別。分型結果提示人葡萄球菌中SCCmec具有多樣性，與國外報道［5］相似。

psm－mec基因是位于SCCmec上的一段DNA片段，一端與mecR1基因相連，另一端與xylR基因相連，主要存在于院內(nèi)感染的SCCmec II型和III型中，研究顯示，在金黃色葡萄球菌中，psm－mec具有調(diào)控MRSA毒力和生物被膜的能力，且psm－mec可存在于人葡萄球菌中［2－6］。為了探討psm－mec在血液來源人葡萄球菌中的分布，在深入分析人葡萄球菌SCCmec型別的基礎上，筆者通過PCR擴增psm－mec基因片段，分析其與SCCmec型別的關系。實驗結果顯示：血液分離的47.6%耐甲氧西林人葡萄球菌攜帶psm－mec基因，而在 MRSA中，大約10% 菌株攜帶psm－mec基因，MRSE中約68%攜帶此基因［6］，說明血液來源的耐甲氧西林人葡萄球菌psm－mec 的攜帶率與 MRSE相當，遠高于MRSA的攜帶率。psm－mec陽性菌株中，70%菌株分布于SCCmecⅢ（IIIA和IIIB）和類III型（SCCmecIIIA－Tn554／orfX， SCCmecIIIA－pI258／Tn544，SCCmecIIIB＋pls），30%分布于SCCmec新型別。在psm－mec陽性的SCCmec新型別中，1株含 mec I、dcs和IS431／pUB110區(qū)域，1株含pls、kdp、mecI和pI258／Tn554區(qū)域，1株含pls、mecI和Tn554／orfX區(qū)域，接下來研究將進一步分析SCCmec新型別。

綜上所述，本研究證實了psm－mec基因在血液來源的人葡萄球菌中分布廣泛，主要存在于SCCmec III型、類III型和SCCmec新型別中，對了解人葡萄球菌的分子特征具有重要意義。

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