張笑乾，李朝正，劉玉芳

（河南師范大學物理與電子信息工程學院，新鄉(xiāng)453007）

1 引 言

細胞色素P450蛋白酶（簡稱P450）是一類血紅素蛋白的超家族，被譽為“世界上最萬能的生物催化劑”，因其在藥物等外源化合物的代謝以及性激素等內源化合物的生物合成過程中的重要催化作用，而被越來越多的人所熟知．這一類單加氧酶可以參與催化眾多化學反應，諸如非活潑碳氫化合物的羥基化反應、脫烷基反應以及脫氨基反應等等[1]．其中，脫氨基反應中的機理細節(jié)，尤其是涉及碳氫鍵氧化過程的一些機理細節(jié)在過去幾十年中引起了相當大的爭議，雖然大量基于此過程的實驗數據和研究結果已被報道，但仍未能完全解決這個頗具爭議性的問題[2－6]．因此，針對相關機理的理論計算，不僅可以揭示反應機理細節(jié)，對相關實驗結果給出合理解釋，還可以使發(fā)現新的機理特征成為可能，從而進一步指導實驗進行更深入的研究．本文以細胞色素P450蛋白酶催化下環(huán)己胺的脫氨基反應為例，對其反應機理細節(jié)進行了研究．

圖1所示為細胞色素P450催化環(huán)己胺脫氨基反應的整個反應過程，其中關于Cα－H鍵的氧化過程涉及兩個假設機理．反應的第一步是環(huán)己胺轉化為相應的碳自由基中間體（Ⅰ－Ⅱ或Ⅲ過程），隨后自由基中間體經過一個氧反彈過程[7－8]（Ⅳ過程）生成1－羥基－環(huán)己胺，接下來1－羥基－環(huán)己胺進一步分解（Ⅴ過程）成為環(huán)己酮和氨氣，整個分解過程可以通過一個水分子的輔助，在非酶環(huán)境中進行．關于機理細節(jié)的爭議主要集中在環(huán)己胺轉變?yōu)樘甲杂苫虚g體這一步．其中一個機理是單電子傳遞（SET）機理[6]（Ⅰ－Ⅱ過程），首先一個電子從環(huán)己胺的氮原子上傳遞到酶活性中心（Ⅰ過程），生成氨基陽離子自由基中間體，然后這個中間體再向酶活性中心傳遞一個質子（Ⅱ過程），至此生成一個碳自由基中間體；與之不同的另外一個機理是氫原子傳遞（HAT）機理[2－5]（Ⅲ過程），即一個氫原子由環(huán)己胺傳遞到酶活性中心，直接生成碳自由基中間體．

在過去幾十年中，支持不同假設機理的研究結果紛紛被報道．一些實驗結果顯示P450催化的脫烷基反應中涉及Cα－H鍵氧化過程的動力學同位素效應相對較小[6，9－12]，是一個Cα的去質子化過程，Kurebayashi[13]進而指出環(huán)己胺的脫氨基反應同樣顯示出較小的動力學同位素效應；同時，在P450及其同功酶的催化下，針對對位取代的苯胺脫甲基反應中線性自由能關系的研究結果得到一個較大的負Hammettρ值，并且反應速率常數與底物的氧化還原勢有關[14－16]．這些研究結果都支持了反應是涉及SET機理的．然而Jurva[17]等人針對P450催化下的環(huán)丙基胺氧化反應的模型電化學－質譜的研究結果顯示，反應中的氨基陽離子自由基中間體并不是必須的；李春森[18]等人針對P450催化苯胺羥基化反應和王永[19]等人針對P450催化N，N-二甲基苯胺脫甲基反應的理論計算結果都無一例外地支持了HAT機理．

圖1 P450催化環(huán)己胺脫氨基反應的兩種假設機理Fig．1 Two hypothetical mechanisms of the deamination of cyclohexylamine catalyzed by P450

為了揭示由P450催化的環(huán)己胺脫氨基反應中涉及的反應機理細節(jié)，我們進行了一系列的密度泛函理論（DFT）計算的研究，并以DFT計算結果為基礎進行了相關的動力學同位素效應計算，結果顯示反應中Cα－H鍵氧化的過程是一個氫原子傳遞過程，從理論計算的角度很好地支持了HAT機理，計算結果還顯示反應最后一步分解過程是在一個水分子的輔助下在非酶環(huán)境中進行的．

2 計算模型與方法

為了通過密度泛函理論計算揭示P450催化環(huán)己胺脫氨基反應的機理細節(jié)，我們使用了Fe4＋O2－（C20N4H12）－（SH）－化 合 物[19－22]作 為 P450氧 化單體Cpd I的模型，使用環(huán)己胺（C6H13N）作為底物．相關的DFT計算通過使用Gaussian 09[23]軟件包來實現，其中涉及混合泛函B3LYP[24]以及兩個基組：一個是 LACVP（Fe）／6-31G＊＊（H，C，N，O，S），簡稱為B1基組，用來對過渡態(tài)和其它穩(wěn)定點進行非對稱性限制的優(yōu)化；另一個是LACV3P＋＊＊（Fe）／6-311＋G＊＊（H，C，N，O，S），簡稱為B2基組，用來進行單點能（E1）和溶劑化校正（E2）的計算．上述計算模型與計算方法已被廣泛應用并被證明是十分可靠的[19，22，25－29]．

通過振動頻率分析，穩(wěn)定點沒有虛頻，而過渡態(tài)有且只有一個虛頻，且該虛頻的振動方向是沿著反應坐標方向的．我們還使用了非極性的PCM溶劑化模型（溶劑是介電常數ε＝5．697的氯苯）來模擬蛋白質環(huán)境下活性中心的極化效應．

為了得到Cα－H鍵氧化過程的動力學同位素效應（KIE）值，我們還利用通過Gaussian計算得到的頻率數據進行了相關的KIE計算，計算主要基于以下兩個方程[30]，第一個是半經驗的Eyring方程，KIE表示為：

其中，k代表反應速率常數，G代表反應Gibbs自由能，R代表氣體常數，T代表絕對溫度，下標s代表了該KIE值是半經驗值．第二個表達式通過將半經驗的 （kH／kD）s與 Wigner量子校正Qcorr因子相乘做了簡單的量子化校正，KIE表示為：

其中ut＝hνH／kBT，＝hνD＇／kBT，ν為過渡態(tài)的虛頻值，下標w代表了該KIE值為Wigner校正值．

3 結果與討論

3．1 P450催化環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應

如圖2所示，與P450催化的其它反應一樣，環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應也是在由兩個簡并的Cpd I基態(tài)引起的不同自旋態(tài)上進行的．反應物階段（RC），在氣相環(huán)境（E1）和溶劑化環(huán)境（E2）下，四重態(tài)和二重態(tài)是簡并的，能差均為0．2kcal／mol．到了過渡態(tài)階段（TS），氣相下四重態(tài)和二重態(tài)的反應能壘分別達到了5．9kcal／mol和5．5 kcal／mol，其能差仍然很小，僅為0．4kcal／mol；而在溶劑化環(huán)境中，其反應能壘分別增加到了7．7 kcal／mol和 6．1kcal／mol，能差被擴大至 1．6 kcal／mol．接下來的氧反彈過程是一個無壘過程，生成了初級產物1－羥基－環(huán)己胺以及弛豫態(tài)的Cpd I，整個過程是一個高放熱過程，在氣相環(huán)境下，四重態(tài)和二重態(tài)的能量分別下降到-60．0kcal／mol和-60．1kcal／mol，有趣的是，能差僅為0．1kcal／mol，這說明整個反應過程符合Shaik提出的“雙態(tài)反應”（TSR）機理[21，31－32]．

圖2 四、二重態(tài)下P450催化環(huán)己胺Ca－H鍵氧化反應的能量過程圖（kcal／mol）．括號外為E1計算水平下的相對能量，括號內為E2計算水平下的相對能量．所有數據都包含了零點能校正．Fig．2 Energy profile（in kcal／mol）for the Cα－H bond oxidation of cyclohexylamine catalyzed by P450on the quartet and doublet states．Relative energies at the E1level are given out of the parentheses and those at the E2level are given in parentheses．All data include ZPE correction．

如圖3所示，在過渡態(tài)階段，沿著反應方向，四重態(tài)中C-H的距離為1．235?，H-O的距離為1．369?，二重態(tài)中C-H的距離為1．185?，H-O的距離為1．472?，相比之下，四重態(tài)的過渡態(tài)更加對稱，并且由于四重態(tài)的C-H距離大于二重態(tài)的C-H距離，所以四重態(tài)的過渡態(tài)相比二重態(tài)更“晚”一點．但是，通過對比反應方向上C-H-O的角度可以發(fā)現，四重態(tài)的C-H-O部分更彎曲，其線性關系并不如二重態(tài)的好．

圖3 Ca－H鍵氧化反應過程中DFT優(yōu)化的四、二重態(tài)過渡態(tài)構型．鍵長單位為?．Fig．3 DFT optimized geometries of the transition state on the quartet and doublet states in the Cα－H bond oxidation process．Bond length is in?．

眾所周知，自旋密度是分析電子結構最準確也是最直觀的方法，因此將P450催化環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應過程中的自旋密度與電荷在表1中列出．在RC階段，兩個自旋態(tài)下底物上的自旋均基本為零，而Cpd I的鐵－氧部分上積聚了約2個單位的自旋，不同的是，四重態(tài)的卟啉－硫氫部分上積聚約1個單位的自旋而在二重態(tài)的卟啉－硫氫部分上積聚了約-1個單位的自旋．到了TS階段，四重態(tài)底物上的自旋密度約為0．5，同時二重態(tài)底物上的自旋密度約為-0．3；與此同時，Cpd I上卟啉－硫氫部分上的自旋密度也發(fā)生了相應的變化，四重態(tài)和二重態(tài)的自旋密度分別約為0．5和-0．5，這說明TS階段涉及了電子從底物向Cpd I卟啉－硫氫部分上傳遞的過程．最后，在PC階段，底物上的自旋密度又變?yōu)榱肆悖鳦pd I上的自旋密度也發(fā)生了相應的變化，這同樣也說明在無壘的氧反彈過程中也涉及了電子的傳遞．結合上述的過渡態(tài)構型的相關信息，整個Cα－H鍵氧化反應過程中底物和Cpd I上自旋密度的變化趨勢充分說明，在反應的過程中，一個氫原子由底物傳遞到了Cpd I上，是一個HAT機理．

表1 四、二重態(tài)下P450催化環(huán)己胺Ca－H鍵氧化反應的自旋密度與電荷Table 1 Spin densities and charges of the Cα－H bond oxidation of cyclohexylamine on quartet and doublet states catalyzed by P450

表2中，四重態(tài)的KIE值為4．9（5．5），略高于二重態(tài)的4．1（5．0），較大的 KIE值也與 Miwa和Kurebayshi等人提出的HAT過程具有較大KIE值的特征相吻合，支持了HAT機理．結合上述TS構型相關信息可以看出，KIE值的大小與過渡態(tài)的的對稱性是成比例的：四重態(tài)的C-H距離為1．235?，明顯長于二重態(tài)的1．185?，其過渡態(tài)較之二重態(tài)也更“晚”，其KIE值也相應的更大．四重態(tài)下過渡態(tài)的對稱性雖明顯好于二重態(tài)，但其KIE值的差異并不大，我們認為這是由于四重態(tài)下過渡態(tài)反應方向上C-H-O部分更彎曲，其線性關系并沒有二重態(tài)好．

2．2 非酶環(huán)境下的1－羥基－環(huán)己胺分解過程

在P450催化環(huán)己胺生成初級產物1－羥基－環(huán)己胺之后，接下來的分解過程是在非酶環(huán)境中通過一個水分子的輔助進行的．從圖4中可以看出，1－羥基－環(huán)己胺的分解過程能壘較高，分別達到了17．0kcal／mol和 13．7kcal／mol，而 產 物 階 段（PC）的能量并沒有下降很多，分別為-6．0kcal／mol和-6．9kcal／mol，可以看出整個分解過程放熱并不強烈．

表2 B3LYP／B1計算水平下P450催化環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應過程的內稟動力學同位素效應值Table 2 Calculated intrinsic KIE values for the Cα－H bond oxidation process of cyclohexylamine catalyzed by P450at the B3LYP／B1level

圖4 非酶環(huán)境下1-羥基－環(huán)己胺水分子輔助分解過程的能量過程圖（kcal／mol）．括號外為E1計算水平下的相對能量，括號內為E2計算水平下的相對能量．所有數據都包含了零點能校正．Fig．4 Energy profile（in kcal／mol）for the decomposition of 1-hydroxycyclohexylamine assisted bya water molecule in nonenzymatic environment．Relative energies at the E1level are given out of the parentheses and those at the E2level are given in parentheses．All data include ZPE correction．

圖5 非酶環(huán)境下1-羥基－環(huán)己胺水分子輔助分解過程中DFT優(yōu)化的關鍵中間體構型．鍵長單位為?．Fig．5 DFT optimized geometries of the key intermediates in the decomposition process of 1-hydroxycyclohexylamine assisted by one water molecule in the nonenzymatic environment．Bond length is in?．

圖5給出了1－羥基－環(huán)己胺分解過程過渡態(tài)的構型信息．水分子在整個分解過程中充當了氫原子傳遞的“shuttle”，將羥基上的氫原子“傳遞”到了氨基上，使得1-羥基－環(huán)己胺分解為環(huán)己酮和氨氣．并且從過渡態(tài)的構型可以看出，1-羥基－環(huán)己胺的分解過程是一個協同的過程．

4 結 論

在P450細胞色素蛋白酶催化的一系列二級胺、三級胺的脫烷基、脫氨基反應中，環(huán)己胺的脫氨基反應因其在生物體代謝過程中的重要地位而倍受關注．該反應中涉及Cα－H鍵氧化過程的機理在一直倍受爭議，為了明確其機理細節(jié)，本文針對P450催化環(huán)己胺脫氨基反應進行了一系列的密度泛函理論（DFT）計算，并在此基礎上計算了

Cα－H鍵氧化過程的動力學同位素效應（KIE）．計算結果顯示，兩個自旋態(tài)的Cα－H鍵氧化反應能壘分別為5．9／5．5kcal／mol，符合Shaik提出的“雙態(tài)反應”（TSR）機理，并且通過對該反應過程中的過渡態(tài)構型以及自旋密度與電荷的分析，證明Cα－

H鍵氧化過程是一個氫原子傳遞過程．同時，動力學同位素效應計算結果顯示Cα－H鍵氧化過程有著較大的 KIE值（4．1／4．9），符合 HAT機理的動力學同位素效應特征．此外，通過針對Cα－H鍵氧化反應的初級產物的分解過程進行了DFT計算，發(fā)現通過一個水分子的輔助，在非酶環(huán)境中整個分解過程放熱并不強烈，并且該過程為一個協同的過程．

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