錢亭，陳茂振，高峰，尹化斌

·實驗研究Experimental research·

經(jīng)肝動脈碘化油/無水乙醇混合劑栓塞消融術(shù)治療兔VX2肝癌的實驗研究

錢亭，陳茂振，高峰，尹化斌

目的通過比較不同容積比例的碘化油-無水乙醇混合劑（Lipiodol-ethanolmixture，LEM）治療兔VX2肝癌模型的效果，確定LEM的最佳容積比例。方法將18只新西蘭白兔按碘化油∶無水乙醇容積比例3∶1（A）、2∶1（B）、1∶1（C）、1∶2（D）、1∶3（E）、1∶4（F）分為6組，每組3只。1周后取腫瘤組織行病理學(xué)檢查，觀察腫瘤生長率，腫瘤微血管密度，腫瘤細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）及腫瘤邊緣肝組織損傷情況。結(jié)果A、E、F 3組腫瘤體積增大，A組腫瘤生長率明顯高于其他5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B、C、D 3組腫瘤體積縮小，但與腫瘤體積增大的E、F組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同容積比例LEM中，無水乙醇比例與腫瘤微血管密度呈負相關(guān)（R2=0.840，F(xiàn)=89.432，P＜0.001）。A組腫瘤AI明顯低于C、D、E、F組（P＜0.05），A、B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B組與C、F組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。A、B組腫瘤周圍肝組織損傷明顯低于其他各組（P＜0.05）。結(jié)論從安全性方面考慮，LEM的最佳容積比例為2∶1。若能做到超選擇插管至腫瘤供血動脈，嚴密透視監(jiān)視下注射，適當提高無水乙醇比例，療效更佳。

肝癌；經(jīng)動脈無水乙醇消融術(shù)；無水乙醇；碘化油；動物實驗

經(jīng)動脈無水乙醇消融術(shù)（transarterial ethanol ablation，TEA）具有微創(chuàng)、價格低廉等外科手術(shù)無法比擬的優(yōu)勢，已較早應(yīng)用于治療原發(fā)性肝癌的基礎(chǔ)及臨床研究，并取得一定療效。但對于不同容積比例的碘化油-無水乙醇混合劑（Lipiodol-ethanol mixture，LEM）的治療效果未達成一致意見。選擇最佳容積比例的LEM對于更好的利用TEA規(guī)范化治療原發(fā)性肝癌有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型建立

1.1.1 實驗動物18只新西蘭白兔，普通級，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，由上海國睿生命科技有限公司提供。荷瘤兔由上海市第九人民醫(yī)院提供。按碘化油∶無水乙醇容積比例3∶1（A）、2∶1（B）、1∶1（C）、1∶2（D）、1∶3（E）、1∶4（F）將兔分為6組，每組3只。

1.1.2 兔VX2肝癌模型的制備荷瘤兔全麻，常規(guī)備皮、消毒、鋪洞巾，完整剝離出腫瘤組織，放入盛有0.9%氯化鈉溶液的換藥碗中。用彎眼科剪去除瘤組織外多余的筋膜、肌肉組織及瘤塊內(nèi)壞死組織。再用彎眼科剪將瘤組織剪碎成1mm3小塊備用。實驗動物術(shù)前禁食，術(shù)中麻醉（鹽酸氯胺酮∶速眠寧Ⅱ為1∶1，0.2～0.3m l/kg）后，仰臥位固定于CT檢查床，CT引導(dǎo)下用18號穿刺針經(jīng)肋間皮膚穿刺至肝左外葉，深約10mm，通過鞘塞入瘤組織塊，術(shù)后2周用于實驗研究［1］。

1.2 方法

1.2.1 影像學(xué)檢查常規(guī)磁共振序列包括T1WI、T2WI抑脂。T1WI采用FSPGR雙回波序列，掃描參數(shù)如下:TE 80ms，TR 900ms，層數(shù)20，層厚3.0mm，層距0.5 mm，視野20 cm，矩陣128×128，激勵次數(shù)1.00。T2W I采用FRFSE抑脂序列:TE 90 ms，TR 3 600 ms，層數(shù)20，層厚3.0 mm，層距0.5 mm，視野20 cm，矩陣128×128，激勵次數(shù)4.00。在T1WI、 T2WI掃描完成后行DWI檢查，DWI采用single shot SE DWIEPI序列，b值取600 s/mm2。具體參數(shù)如下:TE 56 ms，TR 5 000 ms，層數(shù)20，層厚3.0 mm，層距0.5 mm，視野20 cm，矩陣128×128，激勵次數(shù)8.00。術(shù)后1周MRI檢查同前。

1.2.2 TEA術(shù)將模型兔全麻，備皮，仰臥位固定，腹股溝區(qū)常規(guī)消毒、鋪巾，觸摸右側(cè)股動脈搏動最強處做手術(shù)切口，分離和暴露股動脈。用20 G穿刺針穿刺股動脈，引入導(dǎo)絲及微導(dǎo)管，在透視情況下將微導(dǎo)管選擇性插入腹腔干，推注約1m l對比劑造影，然后超選擇性插入肝左動脈［2］，再次推注對比劑造影，以確定微導(dǎo)管位置及腫瘤血供情況。在透視下先給予0.5 ml 1%利多卡因，然后緩慢推注現(xiàn)配的LEM，當看到血流靜止時，停止推注（推注量約為1m l）。術(shù)后結(jié)扎股動脈，保留股深動脈。分層縫合肌肉組織、皮膚。

1.2.3 病理標本制作TEA術(shù)后1周處死動物，完整取出肝臟。標本均用4%甲醛溶液固定（＜24 h），常規(guī)石蠟包埋，切片厚4μm，行常規(guī)HE、CD31免疫組化及TUNEL法染色。

1.2.4 計量資料統(tǒng)計①腫瘤生長率=（腫瘤TEA術(shù)后體積-腫瘤TEA術(shù)前體積）/腫瘤TEA術(shù)前體積×100%。其中，腫瘤體積（V）=L×W2/2，（L代表腫瘤的最大層面長徑，W代表與L垂直的最寬徑）。由于MRI-DWI圖像上腫瘤與周圍組織對比度好，因此長徑及寬徑的測量在MRI-DWI測得。術(shù)前、術(shù)后測量應(yīng)盡可能選擇同一層面。②微血管密度（MVD）計數(shù):采用Weidner等［3］的方法，首先低倍鏡（50倍或100倍）觀察選擇瘤巢內(nèi)及瘤巢周圍MVD最高區(qū)域，即血管“熱點”區(qū)；再在高倍鏡（200倍）視野下計數(shù)微血管數(shù)目，記錄3個視野，取平均值。在計數(shù)微血管時，以與周圍腫瘤細胞和結(jié)締組織成份有明顯區(qū)別的任一染成棕色的血管內(nèi)皮或內(nèi)皮細胞簇作為1個血管計算，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為1個血管計數(shù)。③調(diào)亡指數(shù)（AI）計算:采用TUNEL法染色，讀片時，細胞核染色呈棕褐色者為陽性細胞。每張切片上隨機選取5個視野，并計算出凋亡細胞在全部癌細胞中所占比例，即AI=（凋亡細胞數(shù)/癌細胞總數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA），LSD法及回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成瘤情況及影像表現(xiàn)

18只新西蘭白兔均造模成功并完成各項檢查。術(shù)前，實驗兔肝腫瘤實質(zhì)在MRIT1WI呈等信號，T2WI及DWI呈高信號；術(shù)后腫瘤信號不均勻。見圖1。

2.2 腫瘤生長率

圖1 TEA術(shù)前、術(shù)后腫瘤MRI表現(xiàn)

MRI-DWI圖像中測得腫瘤長徑及寬徑，并計算腫瘤生長率。術(shù)前各組腫瘤直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后，A、E、F 3組腫瘤體積增大，A組腫瘤生長率明顯高于其他各組（P＜0.05），B、C、D 3組腫瘤體積縮小，但與腫瘤體積增大的E、F組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 術(shù)前、術(shù)后腫瘤體積及腫瘤生長率的變化（x±s）

2.3 腫瘤MVD

各組MVD表達情況如表2、圖2所示，不同容積比例LEM組中，無水乙醇比例與MVD呈負相關(guān)（R2=0.840，F(xiàn)=89.432，P＜0.01），見圖3和表2。

2.4 腫瘤AI

A組腫瘤AI明顯低于除B組以外的其他各組（P＜0.05），A、B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B組與C、F組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4和表2。

表2 各組MVD、AI及肝組織損傷情況（x±s）

圖2 MVD表達，內(nèi)皮細胞被染成棕褐色（免疫組化，×400）

2.5 肝組織損傷情況

采用Median Suzuki評分（分期）［4］分別對各組肝組織壞死情況、氣球樣變及腫瘤周圍肝血竇充血情況進行評分并分期，結(jié)果如圖5所示，不同容積比例的LEM與Median Suzuki評分（分期）行相關(guān)性分析，呈正相關(guān)（R2=0.954，F(xiàn)=82.376，P=0.001）。見圖6和表2。

圖3 不同容積比例LEM中，無水乙醇比例與MVD呈負相關(guān)

圖4 術(shù)后7 d，腫瘤凋亡細胞核染成深棕色（箭頭）（TUNEL，×400）

圖5 肝組織壞死、氣球樣變及腫瘤周圍肝血竇充血情況（HE，×200）

圖6 不同容積比例的LEM與Median Suzuki評分（分期）呈正相關(guān)

3 討論

3.1 TEA術(shù)的發(fā)展史及優(yōu)勢

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一。手術(shù)切除是治療早期肝癌的首選方法，但可行手術(shù)切除者不到30%。

介入治療成為不可手術(shù)切除患者的主要治療手段［5］，包括經(jīng)皮穿刺消融和經(jīng)血管栓塞治療。經(jīng)皮無水乙醇化學(xué)消融術(shù)（percutaneous ethanol injection，PEI）是治療小肝癌的有效手段之一，其原理是無水乙醇能快速滲入組織并引起組織蛋白變性、凝固，組織脫水，隨之纖維化。經(jīng)肝動脈化療栓塞（TACE）最常用于不可切除肝癌的初始治療［6］，以碘化油作為栓塞劑，長期隨訪發(fā)現(xiàn)單純TACE近期效果較好，但遠期療效并不理想。無水乙醇作為一種液態(tài)栓塞劑已應(yīng)用于臨床。無水乙醇可破壞血管內(nèi)皮，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞受損、壞死、甚至脫落，血栓形成引起血管閉塞，最終導(dǎo)致腫瘤組織缺血、壞死。

TEA聯(lián)合了無水乙醇及碘化油栓塞的雙重作用，且無水乙醇與碘油混合后也便于透視下觀察栓塞劑的流向，從而避免因栓塞劑反流導(dǎo)致的誤栓。Yu等［7］通過二期臨床試驗證實TEA術(shù)是一種安全、有效的治療不可切除肝癌的方法，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)TACE術(shù)［8］。

3.2 LEM容積比例的選擇

TEA術(shù)中碘化油與無水乙醇的最佳濃度比還未達成一致意見。Cheung等［9］研究表明無水乙醇與碘化油容積比例為3∶1時，可有效、安全治療肝細胞癌。Gu等［10］則認為二者比例為1∶1時效果好。本研究通過比較不同容積比例的LEM治療兔VX2肝癌動物模型的效果，確定LEM的最佳容積比例。綜合分析腫瘤生長率、MVD、AI及肝組織損傷情況，可更全面的判斷不同容積比例LEM對腫瘤的療效。

3.2.1 腫瘤生長率本研究通過測定術(shù)前、術(shù)后腫瘤體積的變化，即TGR初步判定療效。其中，A組腫瘤生長率明顯高于其他各組，提示由于乙醇濃度較低，對腫瘤滅活作用較差，治療后腫瘤仍明顯生長，效果較差。B、C、D 3組腫瘤體積縮小，表明LEM有效作用于腫瘤組織，抑制腫瘤生長。結(jié)合肝損傷結(jié)果分析E、F兩組，腫瘤體積增大可能源于LEM反流入正常肝組織，從而使進入腫瘤組織的量減少，降低了對腫瘤的殺傷作用，但與B、C、D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，仍能表明LEM可阻斷腫瘤血供，破壞腫瘤細胞，減少腫瘤增長速度。

3.2.2 腫瘤MVD MVD被認為是反映腫瘤微血管形成的指標。介入術(shù)后，腫瘤組織缺血、缺氧，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）增加，從而導(dǎo)致VEGF表達升高，它通過刺激血管內(nèi)皮細胞增殖及增加血管通透性促進腫瘤血管生成，MVD計數(shù)增加［11］。本研究中，介入術(shù)后，隨著LEM中乙醇濃度的增加，MVD呈下降趨勢。從而表明高濃度的乙醇更能發(fā)揮其作為消融劑的優(yōu)勢，破壞微血管，減少腫瘤新生血管生成。

3.2.3 腫瘤細胞AI已有實驗表明，介入治療不僅引起肝細胞壞死，還可誘導(dǎo)肝細胞凋亡，AI可反映TEA術(shù)對腫瘤組織的破壞性［12］。本研究中，A組腫瘤細胞AI明顯低于除B組以外的其他各組，A、B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。B組與C、F組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其他各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示高濃度乙醇更能有效誘導(dǎo)細胞凋亡，但其分子機制需進一步探索。

3.2.4 肝損傷情況采用Median Suzuki評分（分期）分別對各組肝組織壞死、氣球樣變及腫瘤周圍肝血竇充血情況進行評分并分期，可判斷不同容積比例LEM對正常肝組織的損傷情況。研究表明，A、B兩組評分明顯低于其他各組，A、B兩組安全性較高。分析原因可能為A、B兩組碘化油濃度較高，DSA下顯影較清晰，能更加有效監(jiān)測肝內(nèi)LEM的流動情況，從而防止LEM進入正常肝組織造成損傷。同時，A、B兩組乙醇濃度較低，對肝組織的損傷作用較弱。因此，隨著乙醇濃度的升高，會引起部分LEM反流入正常肝組織，造成損傷。

本實驗的主要缺點為動物樣本量不足；同時，因VX2兔肝左動脈較細，所選微導(dǎo)管不能超選擇插至腫瘤供血動脈，故當無水乙醇比例較高時導(dǎo)致瘤周肝組織損傷較低無水乙醇組嚴重。

因此，綜合考慮以上各種因素，從安全性方面考慮，碘化油∶無水乙醇的最佳容積比例為2∶1。鑒于隨著無水乙醇比例的增加，腫瘤細胞AI增加，腫瘤區(qū)MVD減少，所以，如能超選擇插管至腫瘤供血動脈，嚴密透視監(jiān)視下注射，適當提高無水乙醇比例，療效會更好。

［1］史東宏，曹建民，許健，等.CT引導(dǎo)下兔VX2肝癌模型的制作及綜合評估［J］.介入放射學(xué)雜志，2008，17:725-728.

［2］江雄鷹，羅榮光，黃金華，等.兔VX2肝癌模型建立與經(jīng)兔股動脈微導(dǎo)管超選擇性肝左動脈插管技術(shù)的探討［J］.介入放射學(xué)雜志，2011，20:214-217.

［3］Weidner N.Tumour vascularity andproliferation:clear evidence of a close relationship［J］.JPathol，1999，189:297-299.

［4］Suzuki S，Toledo-Pereyra LH，Rodriguez FJ，et al.Neutrophil infiltration as an important factor in liver ischemia and reperfusion injury.Modulating effects of FK506 and cyclosporine［J］.Transplantation，1993，55:1265-1272.

［5］陳自謙，楊利，楊熙章，等.肝癌介入治療現(xiàn)狀與進展［J］.介入放射學(xué)雜志，2008，17:223-227.

［6］Vivarelli M，Montalti R，Risaliti A.Multimodal treatment of hepatocellular carcinoma on cirrhosis:an update［J］.World J Gastroenterol，2013，19:7316-7326.

［7］Yu SC，Hui EP，Wong J，et al.Transarterial ethanol ablation of hepatocellular carcinomawith lipiodol ethanolmixture:phaseⅡstudy［J］.JVasc Interv Radiol，2008，19:95-103.

［8］Yu SC，Hui JW，Hui EP，et al.Embolization efficacy and treatment effectiveness of transarterial therapy for unresectable hepatocellular carcinoma:a case-controlled comparison of transarterial ethanol ablation with lipiodol-ethanolmixture versus transcatheter arterial chemoembolizat［J］.JVasc Interv Radiol，2009，20:352-359.

［9］Cheung YC，Ko SF，Ng SH，et al.Survival outcome of lobar or segmental transcatheter arterial embolization with ethanollipiodolmixture in treating hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2005，11:2792-2795.

［10］Gu YK，Luo RG，Huang JH，et al.Transarterial embolization ablation of hepatocellular carcinoma with a lipiodol-ethanol mixture［J］.World JGastroenterol，2010，16:5766-5772.

［11］陳長廣，倪才方，陳瓏.肝動脈栓塞聯(lián)合射頻消融對兔肝癌模型VEGF及MVD的影響［J］.介入放射學(xué)雜志，2013，22:936-939.

［12］蘭春慧，房殷春，樊麗琳，等.介入治療對兔VX2肝癌細胞增殖和凋亡的影響［J］.臨床消化病雜志，2005，17:203-205.

Transhepatic arterial embolization-ablation therapy w ith Lipiodol-ethanolm ixture for the treatment of VX2liver cancer in experimental rabbits

QIAN Ting，CHEN Mao-zhen，GAO Feng，YIN Hua-bin. Department of Radiology，ShanghaiMunicipal Fifth People's Hospital，Shanghai200240，China

YIN hua-bin，E-mail:hbyin1961@126.com

ObjectiveTo determ ine the optimal volumeproportion of iodized oil（Lipiodol）-ethanol mixture by comparing the clinical efficacy of transhepatic arterial embolization-ablation therapy using different volumeproportion of Lipiodol-ethanol mixture in treating experimental rabbitmodels with VX2liver cancer. M ethods VX2tumor was implanted in eighteen adultmale New Zealand white rabbits.The 18 VX2rabbit models were random ly and equally divided into the following six groups according to the Lipiodol-ethanol volume ratio∶groupA（3∶1），groupB（2∶1），groupC（1∶1），groupD（1∶2），groupE（1∶3）and groupF（1∶4）.One week after the treatment，all the rabbits were sacrificed and their livers were removed and sent forpathologic examination.The tumor growth rate，the microvascular density，the apoptosis index（AI）of tumor tissues and the injury of the hepatic tissue adjacent to the tumor were evaluated.ResultsA fter the treatment，the tumor's size was increased in groupA，E and F.The tumor growth rate of groupA was significantly higher than thatof the other five groups，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.The tumor's size of groups B，C and D was decreased，although the difference was not significant when compared with the tumor's size of groups E and F（P＞0.05）.Theproportion of ethanol in Lipiodol∶ ethanolm ixture bore a negative relationshipto themicrovascular density counts（R2=0.840，F(xiàn)=89.432，P＜0.001）.AI of groupA was strikingly lower than that of groups C，D，E and F（P＜0.05）.The difference in AI between groupA and groupB was not significant（P＞0.05），while the difference inAIbetween groupB and groupC or between groupB and groupFwas statistically significant（P＜0.05），and no significant difference in AI existed between each other among other groups（P＞0.05）.The injury extent of the hepatic tissue adjacent to the tumor in groupA and B was remarkably milder than that of other groups（P＜0.05）.ConclusionWhen considered in terms of safety，the optimal volumeproportion of Lipiodol-ethanol mixture should be 2∶1.Successful super-selective catheterization of the tumor feeding artery，strict and close fluoroscopic monitoring of the injection andproper increase in theproportion of ethanol can definitely improve the therapeutic efficacy.（JIntervent Radiol，2014，23:706-710）

liver cancer；transarterial ethanol ablation；ethanol；iodized oil；animalmodel

R735.7

B

1008-794X（2014）-08-0706-05

2013-12-02）

（本文編輯:侯虹魯）

10.3969/j.issn.1008-794X.2014.08.013

上海市閔行區(qū)衛(wèi)生局自然科學(xué)研究課題（2011MHZ19）

200240上海市第五人民醫(yī)院放射科（錢亭、尹化斌）；南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一人民醫(yī)院放射科（陳茂振）；上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院放射科（高峰）

尹化斌E-mail:hbyin1961@126.com