金 一，楊 智△，金 紅，凌 曉，馬 征，鄒晨曦，蔣 娜

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013;2.湖南省疾病預(yù)防控制中心，長沙 410005)

益腎通絡(luò)方由黃芪、制首烏、當(dāng)歸等中藥組成，具有補腎化瘀的作用。臨床及實驗研究表明，對腎病綜合征腎虛夾瘀證有較好的治療效果[1～3]。為給臨床用藥提供安全依據(jù)，根據(jù)國家新藥相關(guān)法規(guī)和技術(shù)規(guī)范[4，5]，筆者對益腎通絡(luò)方進(jìn)行了長期毒理作用研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Sprague Dawley(SD)大鼠由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部提供(生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2009-0012)。6～9周齡SD大鼠80只，體質(zhì)量150±20 g，雌雄各半。

1.1.2 藥物 益腎通絡(luò)方組成藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。采用益腎通絡(luò)方流浸膏:將上述藥材按比例混合后加入85℃左右的水浸沒，熱浸0.5 h后煎煮1 h，過濾，藥渣再加85℃左右的水浸沒，煎煮30 min，過濾并合并煎液。將上述煎液在65℃下濃縮至2.5 g/mL，即得到益腎通絡(luò)方流浸膏。

根據(jù)《中藥新藥研究指南》用藥量以成人的臨床用量推算動物用量，根據(jù)人與大鼠用藥劑量換算法計算，并根據(jù)前期藥效學(xué)實驗結(jié)果。具體如下:(1)益腎通絡(luò)方高劑量(50 g/kg);(2)益腎通絡(luò)方中劑量(25 g/kg);(3)益腎通絡(luò)方低劑量(12.5 g/kg)。

1.1.3 主要儀器及試劑 瑞士Büchi R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本Olympus AU400全自動生化分析儀，美國雅培CD3700全自動血球計數(shù)儀，英國珊頓Finesse325旋轉(zhuǎn)石蠟切片機，日本Olympus BX41TF系統(tǒng)顯微鏡等。Cr(Creatinine，Cr)試劑盒購自上海申能-德賽診斷技術(shù)有限公司，其他試劑盒購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組及給藥 將80只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為益腎通絡(luò)方高劑量組(50.0 g/kg)、中劑量組(25.0 g/kg)、低劑量組(12.5 g/kg)和空白對照組，每組20只。單籠飼養(yǎng)，先于實驗室飼育1周，觀察各組動物體征、體質(zhì)量、毛發(fā)、進(jìn)食、糞便無異常后，分組按劑量每日經(jīng)口灌胃給藥。益腎通絡(luò)方高劑量組灌服50 g/kg益腎通絡(luò)方浸膏水溶液，中劑量組灌服25 g/kg浸膏水溶液，低劑量組灌服12.5 g/kg浸膏水溶液，按2 ml/100 g灌胃給藥1次;空白對照組灌服等體積蒸餾水。大鼠每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量情況調(diào)整藥量，連續(xù)觀察13周。

1.2.2 指標(biāo)檢測 (1)一般情況觀察:單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，試驗期間觀察動物的活動和生長情況，每周加食2～3次，記錄給食量和剩食量，每周稱1次體質(zhì)量，計算食物利用率。每日觀察記錄精神狀態(tài)、活動情況、飲食、二便、毛發(fā)光澤度、體質(zhì)量等;(2)血液學(xué)指標(biāo):13周末次給藥后，每組取14只，雌雄各半，12 h禁食不禁水，乙醚麻醉后舌下采血至抗凝管和非抗凝管，采集的血樣于血細(xì)胞分析儀上檢測紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)血小板(PLT)、白細(xì)胞分類等血液學(xué)指標(biāo);(3)血液生化學(xué)指標(biāo):采集的血樣于非抗凝管血分離血清后，于生化自動分析儀上測定血清中的門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白 (ALB)、血糖 (GLU)、總膽紅素(TBIL)、尿素氮 (BUN)、肌酐 (Gr)、總膽固醇(CHOL)等生化學(xué)指標(biāo);(4)病理組織學(xué)檢查:采血后頸椎脫臼處死動物，對主要臟器進(jìn)行全面尸檢，取肝、脾、腎、睪丸等臟器稱重并計算臟器系數(shù);然后對上述主要臟器及胃、小腸、子宮、卵巢、睪丸、腦等臟器用10%甲醛固定進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查;(5)各組余下大鼠停藥觀察2周后同樣處理，并檢測上述指標(biāo)。在對益腎通絡(luò)方各劑量組動物作大體檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變和生化指標(biāo)改變時，只進(jìn)行高劑量組及空白對照組動物主要臟器的組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

各組動物在灌胃給藥后，由于灌胃刺激出現(xiàn)輕度不適，但很快恢復(fù)正常。試驗期間各組大鼠無死亡，益腎通絡(luò)方中、高劑量組動物出現(xiàn)不同程度的排便量增多，高劑量組表現(xiàn)明顯，糞便稀軟，呈大顆粒或條狀，試驗后期出現(xiàn)腹瀉癥狀。

2.2 生長狀況、進(jìn)食量及食物利用率

表1、2顯示，益腎通絡(luò)方各劑量組動物體質(zhì)量增長緩慢，從第7周開始高劑量組動物體質(zhì)量與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。試驗?zāi)└邉┝拷M動物增重減少，總攝食量和食物利用率降低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 益腎通絡(luò)方對大鼠體質(zhì)量的影響

2.3 血液學(xué)和血生化檢查

表3～5顯示，各劑量組動物的血液學(xué)檢查和各項臨床血生化指標(biāo)均在實驗室正常范圍內(nèi)，給藥期和恢復(fù)期與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 益腎通絡(luò)方對大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、食物利用率的影響

2.4 臟器系數(shù)

表6顯示，試驗?zāi)┦瑱z肉眼觀察各臟器無明顯異常并未見病變，益腎通絡(luò)方各劑量組肝/體、脾/體、腎/體和睪丸/體比值給藥期和恢復(fù)期與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，所有變化在正常范圍內(nèi)。

2.5 病理組織學(xué)檢查

大體觀察:各組大鼠胸腺、心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、回腸、直腸、睪丸(或卵巢)未見異常，也未見膀胱、肝總管結(jié)石。組織學(xué)觀察:對益腎通絡(luò)方高劑量和空白對照組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，動物肝臟被膜完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞索排列整齊;腎臟被膜完整，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常、腎間質(zhì)無異常;胃腸壁各層結(jié)構(gòu)清楚，黏膜上皮完整，黏膜下各層未見充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤;脾臟被膜完整，脾小梁結(jié)構(gòu)正常，紅、白髓比例正常，無炎性細(xì)胞浸潤及色素沉著;睪丸曲精管內(nèi)各級生精細(xì)胞發(fā)育良好，間質(zhì)未見水腫、出血、炎性細(xì)胞浸潤;卵巢上皮與白膜正常，各級卵泡發(fā)育良好，間質(zhì)未見瘀血和炎性細(xì)胞浸潤。

表3 益腎通絡(luò)方對大鼠血常規(guī)的影響

表4-1 給藥期益腎通絡(luò)方對大鼠生化指標(biāo)的影響

表4-2 給藥期益腎通絡(luò)方對大鼠生化指標(biāo)的影響

表5-1 第15周末益腎通絡(luò)方對大鼠生化指標(biāo)的影響

表5-2 第15周末益腎通絡(luò)方對大鼠生化指標(biāo)的影響

表6 益腎通絡(luò)方對大鼠器官/身體質(zhì)量量比影響

3 討論

益腎通絡(luò)方經(jīng)臨床多年運用及前期藥效學(xué)研究均證實，對腎病綜合征腎虛夾瘀證有明顯療效。前期實驗研究還顯示，該復(fù)方對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球細(xì)膜增殖有明顯的抑制作用[6]。本試驗以益腎通絡(luò)方的高、中、低3個灌胃劑量50.0、25.0、12.5 g/kg均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于推薦的臨床給藥劑量2.35 g/kg，其中高劑量組達(dá)到臨床給藥量的20倍，給藥時間90 d，也長于臨床給藥時間15～30 d。

本實驗顯示，連續(xù)給藥90 d后，益腎通絡(luò)方50.0 g/kg劑量組大鼠的體質(zhì)量從第7周開始與空白對照組比較顯著下降，而各劑量組大鼠的血常規(guī)及血清生化指標(biāo)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明益腎通絡(luò)方對大鼠的生長及各項生理指標(biāo)無明顯病理影響。本試驗中，剖檢和病理組織學(xué)觀察心、肝、脾、肺、腎、胃和腸功能均正常，說明益腎通絡(luò)方對大鼠臟器無明顯損傷。

以上結(jié)果表明，益腎通絡(luò)方按照推薦的給藥劑量和給藥療程服用，其長期毒性不明顯，臨床應(yīng)用安全。

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