施偉麗，蘇曉艷，莊淑美，胡雅瓊，高 冬△，宋 軍

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700；2.北京市海淀醫(yī)院，北京 100080；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350122)

缺血模型的建立是缺血性疾病及血管再生研究的一種有效途徑，成功建立一種效果確切、簡(jiǎn)單可靠的肢體缺血模型是保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。動(dòng)物后肢動(dòng)脈表淺的特點(diǎn)，使后肢缺血模型的制作相對(duì)簡(jiǎn)單，也就使得后肢缺血模型在血管新生的研究中頗為多用。本實(shí)驗(yàn)用白及微球栓塞法制作SD大鼠后肢缺血模型，并觀察不同劑量血府逐瘀湯對(duì)該模型缺血組織血管新生的影響，為血府逐瘀湯促血管新生的研究提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

無特定病原體(Specific pathogen Free,SPF)4周齡雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量300±20 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(合格證號(hào)2007000542160，生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(滬)2012-0002)。經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲水，普通高壓飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物及栓塞劑

1.2.1 血府逐瘀湯 采用膠囊制劑，購(gòu)于天津宏仁堂藥業(yè)有限公司(產(chǎn)品批號(hào)A03149)，主要成分為柴胡、當(dāng)歸、甘草、川芎、牛膝、桔梗、地黃、赤芍、紅花、炒桃仁、麩炒枳殼，每粒裝0.4 g。成人口服1次6粒，每日2次。

1.2.2 戊巴比妥鈉 購(gòu)于貝爾曼生物技術(shù)有限公司，德國(guó)分裝進(jìn)口。生理鹽水按質(zhì)量/體積比配置成2%溶液，冰箱儲(chǔ)存容易結(jié)晶，影響麻醉效果，需常溫保存。

1.2.3 白及微球栓塞劑制作 白及膠的抽提：中藥白及50 g于蒸餾水1000 ml中浸泡2 h后，60 ℃水浴4 h，過濾收集濾液；將固體加入800 ml蒸餾水于60 ℃水浴4 h，過濾收集濾液，依次同上經(jīng)過70 ℃、80 ℃后，合并4次濾液，真空抽濾濾液，將濾液濃縮后以無水乙醇沉淀，可得白色絮狀沉淀，干燥后即得白及膠。

栓塞劑白及微球的制作：取干燥好的白及膠配制20%膠液20 ml，以1∶9比例加入含6%司班80的液體石蠟中，50 ℃攪拌30 min后于0 ℃冷卻1 h，室溫?cái)嚢杓尤胍叶分?%固化交聯(lián)，可見微球懸浮于液體中，0 ℃靜置2 h，加入異丙醇靜置，棄上層油相，加入異丙醇重復(fù)洗去油相，加入無水乙醇洗去異丙醇，60 ℃干燥，過200目篩，所得即為直徑為小于75 μm的白及微球栓塞劑。

1．3 儀器

恒溫箱GHP-9050、YB-7LF石蠟包埋機(jī)(湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，HM340E石蠟切片機(jī)(德國(guó)制造)，YT-7FB型攤烤片機(jī)(湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，ECLIP SE55I型生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1．4 方法

1.4.1 大鼠下肢缺血模型的制作 SD大鼠固定后用2%戊巴比妥鈉以3 mL/kg劑量麻醉，完全肌松后從腹股溝處縱向鈍性分離皮下組織，暴露血管神經(jīng)束，分離股動(dòng)脈約0.5 cm，近心端結(jié)扎，用5 mL注射器將無菌生理鹽水配置的4%白及微球栓塞劑懸液0.2 mL推入股動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，作無菌外科縫合，術(shù)后第3天于小腿近心端約1/3處行無菌截肢術(shù)。

1.4.2 分組及給藥方法 術(shù)后第2天將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和藥物組，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)低劑量的藥物未見明顯效果，故藥物組又分血府逐瘀湯常規(guī)劑量和高劑量2組，每組6只。常規(guī)劑量組大鼠每天給藥劑量是正常成人劑量的6倍，即0.48 g/kg/d，高劑量組是常規(guī)劑量組的2倍，分早晚2次灌胃給藥。

圖2 A1-3分別為截肢術(shù)后36、48 h和72 h 100倍鏡下HE表現(xiàn)，B1-3分別為截肢后36、48 h和72 h 400倍鏡下HE表現(xiàn)

1.4.3 取材及HE染色 分別在截肢術(shù)后36 h、48 h和72 h灌藥2 h后用戊巴比妥鈉麻醉，取材肉芽組織，生理鹽水清洗后于中性甲醛固定12 h，經(jīng)石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯脫蠟、不同濃度酒精復(fù)水、蘇木素染色、自來水藍(lán)化、1%濃鹽酸乙醇分化液褪色、伊紅染色后封片、晾干。

1.4.4 病理觀察及血管計(jì)數(shù) 100倍鏡下觀察截肢術(shù)后36 h、48 h和72 h缺血組織的形態(tài)，并選擇血管數(shù)量較多的時(shí)間點(diǎn)400倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行血管數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

圖1顯示，術(shù)后造模肢體與正常肢體相比明顯蒼白；術(shù)后第1天術(shù)側(cè)輕度瘀血，顏色呈淺黑色，跛行；第2、3天精神欠佳，缺血加重，肢體毛發(fā)脫落，拖拽或跛行，趾甲瘀血呈黑色或暗紅色，腳掌可呈深黑色或伴水腫，尤以腳底明顯，或伴指端壞死甚至脫落，或下肢皮膚潰爛伴滲出液；從背部抓起大鼠患側(cè)肢體腳趾不成扇形展開，提起大鼠尾巴時(shí)與正常肢體對(duì)比無趾曲，用Eugenio Stabile半定量評(píng)分法[6]對(duì)肢體功能和缺血損傷評(píng)分發(fā)現(xiàn)這兩項(xiàng)評(píng)分均大于或等于2分。

圖1 A.術(shù)后正常側(cè)肢體，紅潤(rùn)；B.白及微球栓塞側(cè)肢體，呈蒼白色；C.術(shù)后第1天術(shù)側(cè)肢體輕度瘀血；D.術(shù)后第2天患肢腫脹瘀血加重，呈灰黑色，且與正常側(cè)肢體比較患側(cè)足趾不成扇形展開；E.患肢足底

2.2 缺血壞死區(qū)肉芽組織修復(fù)的病理觀察

肉芽組織的生長(zhǎng)時(shí)間及形態(tài)特征使其成為早期組織缺血損傷修復(fù)的重要觀察對(duì)象，其介導(dǎo)的損傷修復(fù)過程包括炎癥反應(yīng)、組織增生和肉芽形成、傷口收縮與瘢痕形成3個(gè)階段，3個(gè)階段彼此重疊，沒有明顯界限。缺血組織3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，截肢術(shù)后72 h膠原纖維增粗并互相融合，呈均質(zhì)紅染的波浪狀、帶狀或片狀結(jié)構(gòu)，纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管少，肉芽組織成熟為纖維結(jié)締組織，并逐漸老化為瘢痕組織(圖A3、B3)。48 h(圖A2、B2)可見，成纖維細(xì)胞向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，胞核變細(xì)長(zhǎng)而深染，胞質(zhì)染色也加深；部分毛細(xì)血管管腔閉塞，或改建為小動(dòng)脈小靜脈；膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，肉芽組織有纖維化趨勢(shì)。36 h(圖A1、B1)各組鏡下均可見新鮮肉芽組織，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞增多及大量毛細(xì)血管管腔形成；成纖維細(xì)胞活躍，呈梭形、核橢圓，染色質(zhì)淺，可伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

由上述病理切片結(jié)果可知，72 h成纖維細(xì)胞分泌的膠原纖維增粗并逐漸融合，血管數(shù)量少，已處于修復(fù)的第三階段；36 h表現(xiàn)為新鮮肉芽組織，新生血管豐富；雖然48 h膠原纖維開始形成，但處于肉芽組織向瘢痕組織過渡的早期纖維化階段，與36 h肉芽組織沒有明顯的界線，兩者具有可比性。綜上，我們選擇36 h和48 h時(shí)間點(diǎn)對(duì)血管數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

2.3 藥物對(duì)缺血壞死區(qū)血管新生數(shù)量的影響

表1顯示，通過血管計(jì)數(shù)結(jié)果可知，48 h的血管數(shù)量較36 h減少，符合肉芽組織的生長(zhǎng)特點(diǎn)。其中36 h兩個(gè)劑量藥物組的血管數(shù)量均比對(duì)照組顯著升高，且高劑量藥物組的血管數(shù)量也明顯高于常規(guī)劑量組。隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，常規(guī)劑量組的藥效消失，但高劑量藥物組保持其藥效作用，血管數(shù)量仍明顯高于對(duì)照組。

表1 血府逐瘀湯對(duì)肉芽組織中血管數(shù)量的影響

注：與生理鹽水組比較:#P<0.05，*P<0.001，與常規(guī)劑量組比較:△P<0.001

3 討論

后肢缺血模型是研究缺血性疾病及血管新生的重要手段。從制作方法來看，多數(shù)研究采用結(jié)扎或切斷股動(dòng)脈或髂動(dòng)脈及其分支的方法制造缺血狀態(tài)[1～5]，但由于鼠科動(dòng)物側(cè)枝循環(huán)豐富，修復(fù)能力強(qiáng)，模型的缺血狀態(tài)多不能持久，且機(jī)械性急性阻斷動(dòng)脈導(dǎo)致的缺血，不符合由慢性血管內(nèi)皮損傷引發(fā)緩慢阻塞所形成的缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。相比較而言，白及微球由白及膠經(jīng)過乳化、凍凝、化學(xué)交聯(lián)而成，直徑小于75 μm，在血流的沖擊下可遷徙阻塞末梢小動(dòng)脈甚至微動(dòng)脈，并在血液中緩慢膨脹不被降解吸收，使缺血效果持續(xù)穩(wěn)定；且白及尤其是白及多糖能促進(jìn)局部血小板凝集、縮短凝血時(shí)間[7]，從而促進(jìn)繼發(fā)性血栓形成，有效模擬內(nèi)皮損傷及動(dòng)脈慢性阻塞過程，更接近此類缺血性疾病的病理狀態(tài)。但是實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物側(cè)支循環(huán)建立能力不一，使得缺血組織壞死潰爛程度不均一，不利于取材點(diǎn)的統(tǒng)一。另外，以該方法造?？扇∮玫娜庋拷M織樣本量較少，給血管新生的藥物研究帶來不便。為解決這個(gè)問題，本實(shí)驗(yàn)在白及栓塞法造模的基礎(chǔ)上，于造模后的第3天對(duì)缺血肢體進(jìn)行低位截肢，既保持肢體的缺血狀態(tài)，又能在統(tǒng)一部位取材，而且由于截肢使得損傷位置上移，增加了可取材肉芽組織的樣本量，通過二次造模克服單純栓塞法造模的局限性，有利于后續(xù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的開展。

缺血損傷修復(fù)的關(guān)鍵在于早期血供的建立，肌肉組織再生性修復(fù)能力弱，需靠新生的、富含毛細(xì)血管的肉芽組織進(jìn)行瘢痕修復(fù)，肉芽組織一般在損傷后第2～3天出現(xiàn)，7 d成熟，該組織的生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)和形態(tài)特征使其成為早期改善缺血、修復(fù)損傷的重要觀察對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)通過觀察缺血組織的病理表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)低位截肢術(shù)后36 h和48 h肉芽組織新鮮，血管數(shù)量豐富，是觀察血管新生的較好時(shí)機(jī)。國(guó)內(nèi)外極少見到將肉芽組織應(yīng)用于血管新生的研究，本項(xiàng)目組突破常規(guī)做法，以病理切片直接計(jì)數(shù)血管數(shù)量，為篩選血管新生藥物提出了一個(gè)較好的在體模型。通過計(jì)數(shù)最佳觀察時(shí)間點(diǎn)的新生血管數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)血府逐瘀湯能促進(jìn)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)肉芽組織的血管生長(zhǎng)。本項(xiàng)目組曾單純采用栓塞劑造模觀察藥物對(duì)肉芽組織血管生長(zhǎng)的影響[8]，雖然與本實(shí)驗(yàn)的藥物制劑不同，給藥時(shí)間長(zhǎng)短不同，但兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論一致，均通過在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該方劑具有促血管新生的功效，為藥物臨床治療缺血性疾病療效顯著提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，本實(shí)驗(yàn)從兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血管數(shù)量比較結(jié)果可知，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，常規(guī)劑量的藥物已失去促血管生長(zhǎng)的作用，且高劑量藥物組的血管數(shù)量較其他兩個(gè)組的差異縮小，提示藥物的作用逐漸消退。說明藥物促血管生長(zhǎng)的作用存在有效時(shí)間范圍，與本項(xiàng)目組其他細(xì)胞模型的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[9，10]，為本項(xiàng)目組提出的血府逐瘀湯促血管適度生長(zhǎng)提供了又一佐證。

本項(xiàng)目組的實(shí)驗(yàn)研究已從不同角度、不同層次說明血府逐瘀湯具有避免血管過度生長(zhǎng)的作用特點(diǎn)，由于血管新生的調(diào)控因子眾多，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，藥物如何能夠調(diào)控血管適度生長(zhǎng)，尚需大量深入的研究，這也為本項(xiàng)目組今后的工作指明了方向。

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