林石明,李兆文,陳魯峰,林俊山,趙學(xué)田,王瑞國,林向前,陳聯(lián)源,許書亮,周琳英

(1.福建省漳州市中醫(yī)院,漳州 363000;2.福建中醫(yī)學(xué)院骨傷系,福州 350003；3.福建醫(yī)科大學(xué)電鏡室,福州 350003)

頸椎病是由于頸椎間盤退變、突出、節(jié)段性不穩(wěn)定、骨質(zhì)增生或骨贅形成等原因在椎管內(nèi)或椎間孔處刺激和壓迫脊髓、頸神經(jīng)根、椎動脈等組織，導(dǎo)致患者出現(xiàn)頸部疼痛、肩臂手麻木、頭痛、眩暈甚至癱瘓等癥狀，其中神經(jīng)根型頸椎病是發(fā)病率最高的1種類型，約占60%～70%，好發(fā)于中老年人，多見于40～60歲人群，嚴(yán)重影響患者的日常生活與工作。對于該病的治療，目前西醫(yī)大多采用非甾體抗炎藥止痛和營養(yǎng)神經(jīng)等對癥治療，遠(yuǎn)期療效欠佳，且由于止痛藥對胃腸的副作用，一部分患者無法耐受。頸椎病屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，采用中醫(yī)藥治療取得一定療效，且沒有毒副作用。我院根據(jù)老中醫(yī)驗(yàn)方頸痛寧研制而成頸康片，用于治療神經(jīng)根型頸椎病10余年取得顯著療效，并未發(fā)現(xiàn)毒副作用[1]。我們經(jīng)過系列實(shí)驗(yàn)研究[2～4]證實(shí)，該藥使用安全，具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)作用，同時(shí)對頸椎間盤髓核炎癥介質(zhì)能夠起到干預(yù)作用。由于神經(jīng)根型頸椎病的發(fā)病基礎(chǔ)是頸椎間盤退行性改變所致，故本實(shí)驗(yàn)采用透射電鏡從細(xì)胞水平及亞細(xì)胞水平觀察頸康片對退變頸椎間盤髓核超微結(jié)構(gòu)的影響，以初步探討該藥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6個月齡新西蘭兔28只，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供(實(shí)驗(yàn)動物合格證書號96(001)號)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施為兔類實(shí)驗(yàn)室清潔級(合格證書號醫(yī)動學(xué)第 98(001)號)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

頸康片(閩藥制字Z06602035)原藥材由漳州市醫(yī)藥公司統(tǒng)一購進(jìn)，由漳州市中醫(yī)院制藥廠負(fù)責(zé)加工制備，1 ml含生藥3.6 g(批號001009)；頸復(fù)康由承德中藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供(批號080193)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

透射電鏡，Hu-12A型,日本產(chǎn);醫(yī)用X線診斷機(jī)，300 mA 國產(chǎn)(北京);Olympus 萬能顯微鏡，BH-2型,日本產(chǎn);石蠟切片機(jī)，CUT4060型,德國產(chǎn)。

1.4 動物造模、分組、給藥、取材

1.4.1 分組及造模 28只6月齡新西蘭兔雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組20只，正常對照組8只。編號后分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，喂以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，保持飼養(yǎng)房濕度60%～80%，濕度適宜24 ℃～28 ℃，通風(fēng)良好，采光條件可。

造模方法參照文獻(xiàn)[4～6]進(jìn)行，模型組用鹽酸氯胺酮肌注麻醉(0.1 g/kg)后，取俯臥位于手術(shù)桌上，頸部剪毛消毒后，取頸部后正中切口，自枕外粗隆至胸1，長約8～10 cm，逐層切開皮膚、皮下組織，找出項(xiàng)韌帶將其切除，自椎板往兩側(cè)剝離椎旁肌肉，將其部分切斷，然后將頸椎棘間韌帶切斷，仔細(xì)止血后，觀察無活動性出血點(diǎn)，逐層縫合。術(shù)后肌注慶大霉素1次預(yù)防感染(4萬U/只)。1周后傷口愈合，即將模型組新西蘭兔關(guān)進(jìn)特制低頭位兔籠中，每天2次，每次2 h，持續(xù)8周。術(shù)后8周，模型組及正常對照組各處死2只新西蘭兔，然后將模型組分為頸康片組、頸復(fù)康組及生理鹽水組，每組6只。

1.4.2 給藥及取材 術(shù)后8周，頸康片組及頸復(fù)康組開始給藥，用藥劑量按《動物體表面積比率換算等劑量法》，由正常人每日常用劑量換算得出。頸康片組給藥量為3.6 g/kg·d，頸復(fù)康組給藥量為4.0 g/kg·d，給藥前選用生理鹽水將頸康片浸膏配成0.36 g/ml溶液，頸復(fù)康沖劑配成0.4g/ml溶液，采用灌胃法給藥每天1次，按10 ml/kg·d喂食藥物；而生理鹽水組及正常對照組分別按10 ml/kg·d灌服生理鹽水，連續(xù)喂食4周。

術(shù)后4、8周后進(jìn)行頸椎拍片檢查，術(shù)后8周模型組及正常對照組各處死2只新西蘭兔，取頸4-5椎間盤髓核組織進(jìn)行顯微鏡觀察。給藥4周后處死全部新西蘭兔，取出頸4-5椎間盤髓核，每組取2個頸4-5髓核，經(jīng)固定、切片等處理后進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 頸椎X線攝片檢查 正常對照組與模型組新西蘭兔均于術(shù)后4周、8周采用鹽酸氯胺酮肌注麻醉后拍攝頸椎側(cè)位X線片。

1.5.2 透射電鏡觀察髓核超微結(jié)構(gòu) 取頸4-5椎間盤髓核約1mm3，經(jīng)過前固定、漂洗、后固定、系列脫水、包埋、染色及切片后上銅網(wǎng)，于日立Hμ-12A電子顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞、膠原纖維超微結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 X線片檢查結(jié)果

各組新西蘭兔均于術(shù)后4周及術(shù)后8周在同樣攝片條件下拍攝頸椎側(cè)位X線片(圖1～4所示)，參照余氏評分法[3]觀察椎間孔縮小程度、生理弧度改變、椎間隙是否變窄、椎體前后緣骨質(zhì)有無增生、頸椎上下關(guān)節(jié)突骨質(zhì)有無增生等方面，對X線片進(jìn)行評分。

圖1 正常對照組頸椎側(cè)位片圖

圖2 模型組實(shí)驗(yàn)4周頸椎曲度反弓

圖3 模型組實(shí)驗(yàn)8周頸椎曲度變平，頸4椎體前緣增生

圖4 模型組實(shí)驗(yàn)8周椎間隙明顯狹窄，頸4-5 前緣增生，后關(guān)節(jié)間隙模糊

組 別4周8周模型組210±097﹡440±164＊＊﹟正常對照組150±105150±105

注：術(shù)后4周與正常對照組比較：﹡P>0.05; 術(shù)后8周與正常對照組比較：﹡﹡P<0.01; 術(shù)后8周與4周對比：﹟P<0.01

表1顯示，術(shù)后4周模型組頸椎X線片評分與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明造模4周造模組頸椎退變不明顯。術(shù)后8周，模型組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；造模組術(shù)后8周與術(shù)后4周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明造模8周模型組退行性改變非常明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 超微結(jié)構(gòu)觀察

2.1 正常對照組

膠原纖維排列較有規(guī)則，分布密度較均勻，原纖維的粗細(xì)及相互間距大致相同，軟骨樣細(xì)胞呈橢圓形、短梭形或核橢圓形，胞漿內(nèi)有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、糖原等細(xì)胞器。有的細(xì)胞周圍見細(xì)胞周質(zhì)，主要由細(xì)絲及顆粒狀物質(zhì)組成 (圖5a、b)。

2.2 生理鹽水組

病變重、膠原原纖維多數(shù)已溶解，僅殘余一些定形物質(zhì)，軟骨樣細(xì)胞已壞死，巢內(nèi)僅留有電子密度高的細(xì)胞碎渣。有些壞死軟骨樣細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)仍可見，有些細(xì)胞周質(zhì)亦溶解 (圖6a、b、c、d)。

圖5a 正常對照組髓核軟骨細(xì)胞(×7000)

圖5b 正常對照組膠原纖維(×7000)

2.3 頸康片組

病變中等，多數(shù)膠原原纖維排列較規(guī)則，部分區(qū)域膠原原纖維變性為團(tuán)塊狀高電子密質(zhì)物，個別區(qū)域膠原原纖維有溶解，局部殘余小空隙或?yàn)闊o定形物質(zhì)充填。絕大多數(shù)軟骨樣細(xì)胞改變輕，僅見細(xì)胞內(nèi)線粒體等細(xì)胞器略有腫脹，有些軟骨樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，壞死的細(xì)胞少見，但幾乎大部分細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)明顯增厚并變性，見一些塊狀高電子密度物質(zhì)堆積(圖7a、b)。

2.4 頸復(fù)康組

病變?nèi)暂^重，部分膠原原纖維排列稀疏、較紊亂，部分膠原原纖維溶解，局部殘余較大的空隙或殘余一些無定形物質(zhì)，絕大多數(shù)軟骨樣細(xì)胞壞死，偶見一些結(jié)構(gòu)尚可的軟骨樣細(xì)胞，但其胞漿內(nèi)脂肪滴有增多，線粒體有腫脹，有的軟骨樣細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)增厚明顯(圖8a、b)。

圖6a 髓核軟骨細(xì)胞壞死 (×3600)

圖6b 髓核軟骨細(xì)胞裂解壞死(×4800)

圖6c 膠原纖維稀疏、排列不整齊(×6000)

圖6d 膠原纖維扭結(jié)成毛線團(tuán)狀(×15200)

圖7a 頸康片組髓核軟骨細(xì)胞輕度退變(×4000)

圖7b 膠原纖維排列較規(guī)則，但部分?jǐn)嗔?×4800)

圖8a 頸復(fù)康組髓核軟骨細(xì)胞輕度退變(×7000)

圖8b 膠原纖維排列輕度紊亂，部分?jǐn)嗔?×6000)

3 討論

3.1 關(guān)于頸椎病動物模型的建立

頸椎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，故復(fù)制其模型較困難。目前國內(nèi)外學(xué)者通過多種方法復(fù)制其模型，并對其發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了諸多探討。Whitehill[7]通過損傷狗的前縱韌帶纖維環(huán)和所有后部韌帶結(jié)構(gòu)造成頸椎不穩(wěn)，術(shù)后3個月成模，并從放射學(xué)、生物力學(xué)及組織形態(tài)學(xué)方面對模型的恢復(fù)進(jìn)行研究。Miyamoto[8]通過分離鼠脊柱后部附著于椎體的肌肉及切除棘突、棘上韌帶和棘間韌帶來造成頸椎病的模型，術(shù)后6～12月成模，并首次從病理學(xué)上證實(shí)頸椎病模型的成立。彭寶淦[5]通過切除兔頸棘上、棘間韌帶和分離椎旁兩側(cè)的肌肉，3個月后建立頸椎病模型，并通過X線攝片檢查及顯微鏡觀察證實(shí)模型的成立。余家闊等[6]根據(jù)長期低頭伏案工作的人易得頸椎病的情況，將家兔放入特制的低頭位兔架中，每次低頭2 h，每天2次，2個月后建立了頸椎病模型。此外，施杞等[9]根據(jù)中醫(yī)病因?qū)W說，將風(fēng)寒濕的刺激引入頸椎病造模過程中。實(shí)驗(yàn)中觀察到，長期低頭體位可造成頸部肌肉變性，加之風(fēng)寒濕的不斷刺激，加重了頸椎退行性改變。彭寶淦等[5]對頸椎病動物模型的椎間盤進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，在普通顯微鏡下見3個月造模組椎間盤纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙，排列輕度不規(guī)則，髓核出現(xiàn)皺縮或變小。8個月造模組椎間盤髓核完全纖維化，纖維環(huán)板塊層狀結(jié)構(gòu)消失、玻璃樣變。赫永強(qiáng)等[10]采用透射電鏡觀察動物模型退變性頸椎間盤髓核超微結(jié)構(gòu)的變化，可見造模2個月后開始出現(xiàn)退變軟骨樣細(xì)胞，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞漿濃縮，線粒體腫脹，嵴消失，可見“髓鞘樣”小體。

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法，將彭寶淦與余家闊兩者的方法結(jié)合起來進(jìn)行造模[5，6]，對術(shù)后4周及8周新西蘭兔進(jìn)行拍片檢查，并參照余氏法評分對頸椎X線片進(jìn)行評分及統(tǒng)計(jì)分析，模型組與正常對照組比較(P>0.05)，結(jié)果表明術(shù)后4周新西蘭兔頸椎退變不明顯；術(shù)后8周模型組與正常對照組比較，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明新西蘭兔頸椎發(fā)生明顯退變，與人體頸椎病椎間盤退變的病理改變相符。

3.2 頸康片方藥分析

根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，頸椎病屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，神經(jīng)根型頸椎病主要病機(jī)是肝腎虧虛、風(fēng)寒入侵、氣血經(jīng)絡(luò)失調(diào)，治療原則為扶正祛邪。頸康片具有補(bǔ)益肝腎、活血化瘀、溫經(jīng)除痹等作用，由續(xù)斷、葛根、桂枝、川芎、白芍、甘草、雞血藤、威靈仙、制馬錢子、羌活、桑枝、天麻等組成，其中續(xù)斷補(bǔ)益肝腎、行血脈、續(xù)筋骨；川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛；川芎 “上行頭目，下行血?！保L于通行血脈，行氣活血止痛”。雞血藤行血補(bǔ)血、舒筋活絡(luò)；威靈仙祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛；桂枝祛風(fēng)寒濕、溫經(jīng)通絡(luò)、辛溫發(fā)散，透達(dá)營衛(wèi)，善于外行肌腠，去除風(fēng)寒?！妒颐劁洝吩唬骸笆种槟荆藲馓擄L(fēng)濕中之，必須用手經(jīng)之藥引手中，而去風(fēng)去濕之藥始能有效……然必得桂枝，始能入于手經(jīng)也?！卑咨逐B(yǎng)血斂陰、柔肝止痛，同時(shí)桂枝與白芍相合，一治衛(wèi)強(qiáng)、一治營弱，合則調(diào)和營衛(wèi)，相須為用；羌活祛風(fēng)勝濕、散寒止痛，配伍桑枝祛風(fēng)通絡(luò)、利關(guān)節(jié)、止痹痛，尤其適宜于上肢痹痛；天麻祛風(fēng)濕、止痹痛，用于風(fēng)濕痹痛及肢體麻木等證；葛根發(fā)表解肌、善治項(xiàng)背強(qiáng)痛，又可作為頸項(xiàng)部疼痛的引經(jīng)藥；葛根有良好的發(fā)表解肌作用，為解肌之代表藥，常用于外感六淫之邪侵襲肌表引起的項(xiàng)背拘急之證；馬錢子通絡(luò)散結(jié)、消腫定痛，常用于風(fēng)濕痹痛或拘攣麻木等癥?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》認(rèn)為，本藥“開通經(jīng)絡(luò)，透達(dá)關(guān)節(jié)之力，遠(yuǎn)勝它藥”。

3.3 頸康片對退變頸椎間盤髓核超微結(jié)構(gòu)的影響

頸椎病好發(fā)于中老年人，當(dāng)椎間盤發(fā)生退變時(shí)，其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)必然會發(fā)生一些變化。本實(shí)驗(yàn)研究肉眼觀察可見，正常對照組椎間盤中央矢狀面剖開后髓核呈水凝膠狀突出；而生理鹽水組、頸康片組及頸復(fù)康組均見髓核變薄、含水量均有不同程度減少，呈軟黏稠膠狀，反光性減弱，其中生理鹽水組外觀改變最明顯，由此可見其退變最嚴(yán)重。在給藥4周后，通過電鏡觀察，頸康片組、頸復(fù)康組及生理鹽水組等3組均有不同程度退變的表現(xiàn)，其中生理鹽水組髓核退變程度最重，部分細(xì)胞退變、大部分細(xì)胞已壞死，膠原纖維明顯退變；而用藥2組髓核退變相對較輕，其中頸康片組髓核退變程度最輕，說明頸康片能夠減輕新西蘭兔頸椎間盤髓核組織軟骨細(xì)胞及其膠原纖維的退變程度。Hashizume[11]的研究表明，椎間盤退變形態(tài)學(xué)首先產(chǎn)生的變化是部分軟骨板從鄰近椎體的分離。纖維環(huán)與軟骨板是椎間盤的兩條營養(yǎng)途徑,當(dāng)纖維環(huán)與軟骨板的變性勢必破壞了椎間盤內(nèi)外物質(zhì)的交換,促進(jìn)了椎間盤退變，因此我們推測頸康片可能也是通過減輕纖維環(huán)與軟骨板的變性，從而減輕椎間盤退變。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為，“丈夫……五八，腎氣衰……七八，肝氣衰。”肝主筋，腎主骨，人到中年肝腎漸虧，筋骨容易發(fā)生退化。椎間盤屬于“筋”的范疇，通過補(bǔ)益肝腎能夠強(qiáng)筋壯骨，所以頸康片能夠起到減輕頸椎間盤退變程度，改善神經(jīng)根型頸椎病的癥狀。但從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來看，頸康片通過什么途徑發(fā)揮減輕頸椎間盤退變的作用，頸椎間盤退變程度減輕與癥狀的相關(guān)性等問題尚需今后進(jìn)一步的研究。

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