緱敬軒, 董文賓, 曾 橋

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

幾丁質(zhì)(Chitin)又稱甲殼素、甲殼質(zhì),是地球上蘊(yùn)藏最豐富的有機(jī)物之一[1].其水解產(chǎn)物幾丁寡糖具有抗真菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤以及抗植物病蟲害等功能，已在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和保健等方面得到廣泛應(yīng)用[2-5].這些幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物目前主要用化學(xué)降解的方法生產(chǎn)，對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染.酶降解法則具有條件溫和，得率高且無污染等優(yōu)點(diǎn)，是公認(rèn)的最佳生產(chǎn)工藝[6].但目前所選菌株產(chǎn)酶能力和酶活性均比較低，不能滿足生產(chǎn)的需要，因此幾丁質(zhì)酶在實(shí)際中應(yīng)用程度還并不高[7,8].故篩選產(chǎn)酶量高的菌株，尋找合適的發(fā)酵工藝，是微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶研究的當(dāng)務(wù)之急[9-12].本實(shí)驗(yàn)室在前期篩選到的一株幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌株Z4，初步鑒定屬于微桿菌屬，本文對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，以期提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量，了解該菌株的特性，為進(jìn)一步的發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)該酶和工業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：菌株Z4，本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離獲得.

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：參照DiPietro的配方[13]，稍作改變.KH2PO40.03 g、 K2HPO40.07 g、FeSO4·2H2O 0.001 g、 MgSO4· 7H2O 0.05 g、ZnSO40.000 1 g、膠體幾丁質(zhì)0.2 g、酵母膏0.2 g、水100 mL(pH7.0).

試劑： 幾丁質(zhì)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，N-乙酰氨基葡萄糖(生工生物工程(上海)有限公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的制備

膠體幾丁質(zhì)的制備參考Rodriguez的方法[14]，并略作修改：稱20 g幾丁質(zhì)加入200 mL濃鹽酸，在40 ℃攪拌3 min，使之溶解.溶液中加入2 L 4 ℃的冷水，過濾后的膠體沉淀用蒸餾水洗滌至中性.

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

菌株活化后，以4%的接種量將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，160 rpm恒溫培養(yǎng)96 h,每隔24 h取樣，測定幾丁質(zhì)酶活性.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別考察培養(yǎng)溫度、接種量、初始pH和裝液量對菌株Z4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響.

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對以上因素進(jìn)一步優(yōu)化.具體因素水平安排見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 發(fā)酵液酶活測定

參照Antonio的方法[15]：取0.5 mL上清液與0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)混合，37 ℃恒溫30 min，放入沸水浴5 min，立即冷卻，并用DNS法[16]測定還原糖.酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放相當(dāng)于1μmol NAG所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U).

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溫度對產(chǎn)酶的影響

在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，改變培養(yǎng)溫度，比較25 ℃，28 ℃，31 ℃，34 ℃，37 ℃ 5個(gè)不同培養(yǎng)溫度下發(fā)酵液酶活的變化.Z4產(chǎn)酶情況如圖1所示，由圖1可看出，在實(shí)驗(yàn)測定的不同發(fā)酵時(shí)間中，28℃培養(yǎng)的發(fā)酵液中產(chǎn)酶量在24 h至48 h增長迅速，此后一直保持最高的酶活，酶活性明顯大于其他培養(yǎng)溫度.故該培養(yǎng)條件下，最適產(chǎn)酶的溫度為28 ℃.

圖1 溫度對產(chǎn)酶的影響

2.1.2 接種量對產(chǎn)酶的影響

將種子培養(yǎng)液按2%、4%、6%、8%、10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他培養(yǎng)條件不變，每隔24 h測一次發(fā)酵液酶活力，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知，接種量為4%時(shí)，酶的產(chǎn)量在24～48 h增加最快，且產(chǎn)量最高.但是48 h以后，接種量為8%的發(fā)酵液中酶活力迅速增加并在72 h后超過其他幾種接種量的發(fā)酵液，保持最大產(chǎn)酶量.故選擇8%為最適接種量.

圖2 接種量對產(chǎn)酶的影響

2.1.3 初始pH對產(chǎn)酶的影響

圖3 初始pH對產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)液的起始pH值分別調(diào)為5、6、7、8、9，進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h測定一次發(fā)酵液的酶活力(圖3).從圖3可看出，pH值為7時(shí)，產(chǎn)酶量最高, 達(dá)到2.525μ/mL；pH值為6、8和9時(shí)，酶產(chǎn)量次之；pH為5時(shí)，酶產(chǎn)量最低，而且與其他幾種pH值時(shí)發(fā)酵液酶的產(chǎn)量差距很大.由此看來，pH中性條件適宜菌體產(chǎn)酶，隨著pH值的增加或減少都會影響菌體幾丁質(zhì)酶的合成，pH值降低影響更大.

2.1.4 裝液量對產(chǎn)酶的影響

在250 mL三角瓶中分別裝40 mL、50 mL、60 mL、75 mL、100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h測定發(fā)酵液的酶活(圖4).結(jié)果表明，裝液量為50 mL的發(fā)酵液在48 h后產(chǎn)酶量高于其他裝液量的發(fā)酵液，但是差值不是很大.所有裝液量的發(fā)酵液中，幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量基本保持相同的趨勢，即48 h前，增長不明顯，48～72 h，酶產(chǎn)量快速增加，而72 h以后，基本趨于穩(wěn)定.該趨勢同Z4生長曲線特征基本一致，說明菌體數(shù)量的增加同幾丁質(zhì)酶的合成具有一定的相關(guān)性.這是因?yàn)樵诎l(fā)酵培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)為微生物的生長提供碳源，Z4需要通過幾丁質(zhì)酶系的作用才能把幾丁質(zhì)降解為可以吸收利用的寡糖或單糖，因此幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量影響菌株對碳源的利用，進(jìn)而影響菌體生長.

圖4 裝液量對產(chǎn)酶的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)確定Z4發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳條件，利用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1，對正交結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析.試驗(yàn)結(jié)果和分析見表2和表3.

極差分析表明，對酶產(chǎn)量影響最大的因素為溫度，其次為pH，接種量和裝液量影響最小.其中溫度對酶產(chǎn)量影響明顯大于其他三個(gè)因素.方差分析也證明四個(gè)因素中只有溫度對酶產(chǎn)量的影響具有顯著性，與極差分析結(jié)果一致.

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，Z4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳條件為A2B1C2D3，即培養(yǎng)溫度28 ℃，起始pH為7，裝液量60 mL，接種量為6%.

表3 L9(34) 正交試驗(yàn)方差分析表

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過三因素四水平的正交試驗(yàn)確定Z4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)基初始pH為7，接種量為6%，三角瓶裝液量為60 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶.在該發(fā)酵條件下，所得發(fā)酵液酶產(chǎn)量達(dá)到4.13 U/mL,與優(yōu)化前的酶產(chǎn)量2.3 U/mL相比，提高了79.6%.

該菌株雖然經(jīng)過條件優(yōu)化，產(chǎn)酶能力顯著增加，但距離工業(yè)化應(yīng)用還有一定差距.作為一株野生型菌株，同其他已經(jīng)報(bào)道的野生型菌株一樣產(chǎn)酶能力還達(dá)不到實(shí)際應(yīng)用的要求，都需要進(jìn)一步誘變育種或基因改造.該菌株相對較高的產(chǎn)酶能力保證其可以作為一個(gè)優(yōu)良的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變育種或雜交育種的親本.本實(shí)驗(yàn)通過對溫度、pH、轉(zhuǎn)速、裝液量等不同發(fā)酵條件的組合優(yōu)化，初步掌握了該菌株適合的培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步的育種提供依據(jù).

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