潘小鵲 浙江省中醫(yī)院 杭州 310006

紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620凋亡及機(jī)制研究

潘小鵲 浙江省中醫(yī)院 杭州 310006

目的探討紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620凋亡及分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，加入終濃度分別為2.5～15μmol/L的紫草素。采用MTT法測(cè)定紫草素對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot方法測(cè)定對(duì)bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平。結(jié)果紫草素隨時(shí)間和濃度的增加對(duì)SW620細(xì)胞增殖抑制率增加，細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）。Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)bax蛋白表達(dá)升高同時(shí)bcl-2蛋白表達(dá)下降。結(jié)論紫草素有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，可以通過調(diào)控bax和bcl-2蛋白的表達(dá)經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

結(jié)腸癌；SW620；體外培養(yǎng)；細(xì)胞凋亡；bax；bcl-2；紫草素

紫草素（shikonin）是從傳統(tǒng)中藥紫草的根部提取的一種萘醌類化合物。研究表明，紫草素可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1-4]。但關(guān)于紫草素抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究較少，特別是對(duì)結(jié)腸癌的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要研究紫草素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620凋亡的影響，初步探討其抗腫瘤作用的機(jī)制，為進(jìn)一步闡明紫草素抗腫瘤作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620購(gòu)自上海中科院腫瘤細(xì)胞所，在含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液、37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2試 劑 胎牛血清（Gibco）；F12培養(yǎng)基（Gibco）；MTT（Sigma）；Apoptosis Assay細(xì)胞凋亡試劑盒（BD）；bax、bcl-2、β-actin及抗兔和抗鼠的二抗（cell signal）。紫草素購(gòu)自中國(guó)藥品制品檢定所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) SW620細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為2.5、5、10、15μmol/L的紫草素，對(duì)照組加入等體積的1640培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)平行孔6個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清，加入150μL DMSO溶解，酶標(biāo)儀540nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算SW620細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制率=（1-樣本OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

2.2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，以5×104個(gè)細(xì)胞/mL接種于6孔板，每孔1mL。實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為2.5、5、10、15μmol/L的紫草素，對(duì)照組加入等體積的1640培養(yǎng)基，作用24h，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡的百分比。

2.3Western-Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集不同藥物濃度作用24h后的SW620細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液100μL，離心，蛋白定量。10%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉后依次加入第一、二抗體，在室溫下孵育2h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，過氧化物酶法顯色，凝膠纖維攝像系統(tǒng)處理。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用（） 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1紫草素抑制細(xì)胞增殖作用 與對(duì)照組比較，2.5、5、10、15μmol/L濃度的紫草素處理細(xì)胞24h，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率分別為（7.9±0.7）%、（18.2± 0.6）%、（31.2±0.4）%、（40.5±0.3）%，紫草素各濃度組作用48h抑制率分別為（11.3±0.5）%、（30.4±0.5）%、（46.5±0.5）%、（66.8±0.6）%，均較對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）。紫草素對(duì)SW620細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的時(shí)間劑量效應(yīng)關(guān)系，見圖1。

圖1 紫草素對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制作用

3.2紫草素誘導(dǎo)凋亡的作用 2.5、5、10、15μmol/L紫草素處理SW620細(xì)胞24h后，采用AnnexinVFITC/PI雙染方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，早期凋亡為AnnexinV-FITC單染，晚期凋亡為AnnexinV-FITC和PI雙染，單染PI的細(xì)胞為死細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著藥物濃度的增加，紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組（等體積1640培養(yǎng)基）相比顯著增加，見表1。

3.3紫草素對(duì)bcl-2和bax表達(dá)的影響 紫草素作用24h后，Western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示bax蛋白表達(dá)水平隨藥物濃度的增加而增加，而bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，見圖2。

表1 紫草素誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡率（） %

表1 紫草素誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡率（） %

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

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圖2 紫草素對(duì)SW620細(xì)胞bax、bcl-2蛋白的影響A：0μmol/L紫草素；B：2.5μmol/L紫草素；C：5μmol/L紫草素；D：10μmol/L紫草素；E：15μmol/L紫草素

4 討論

紫草素是從紫草根中提取的化合物。研究表明，紫草素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤作用，可以誘導(dǎo)自噬抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5]，調(diào)控P53基因[1]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；抑制bcl-2表達(dá)，減少巰基化合物、蛋白巰基化合物和谷胱甘肽的水平等方式誘導(dǎo)白血病HL-60凋亡[3-4]；紫草素通過刺激活性氧繼而活化JNK和p38，引起線粒體蛋白細(xì)胞色素c釋放，通過線粒體途徑誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562凋亡[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620有抑制生長(zhǎng)的作用，流式檢測(cè)結(jié)果證實(shí)紫草素體外有誘導(dǎo)SW620凋亡的作用。bcl-2家族蛋白是重要的細(xì)胞線粒體凋亡調(diào)節(jié)因子，蛋白成員間的相互作用對(duì)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示紫草素上調(diào)bax的同時(shí)下調(diào)bcl-2的表達(dá)，表明紫草素可能通過調(diào)控bcl-2、bax，進(jìn)而激活caspase導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，紫草素能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，通過影響bax和bcl-2蛋白的表達(dá)通過線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

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修回日期：2014-03-05

Molecular Mechanism of Shikonion-induced Apoptosis of SW620 Cells

PAN Xiaoque. Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effects of Shikonion on apoptosis of human SW620 and explore the underlying molecular mechanism.MethodsHuman colon cancer cell SW620 was cultured in virto and treated with various concentrations(2.5-15 μmol/L)of Shikonion.Cell proliferation was examined by MTT assay and cell apoptosis were detected by Annexin V-FITC/PI double staining.The expression of bcl-2 and bax protein were detected by Western blot.ResultsShikonion inhibited the growth of SW620 cells in a dose and time-dependent manner. SW620 cells treated with Shikonion for 24h showed significantly enhanced apoptosis as compared with control cells（P＜0.05）.Shikonion decreased bcl-2 and increased bax protein.ConclusionShikonion may inhibit the proliferation and induce apoptosis of SW620 cells by changing the levels of bcl-2 and bax proteins.These findings indicated that depolarization of the mitochondrial membrane potential might be involved in Shikonion induced apoptosis.

colon cancer；SW620；in vitro；apoptosts；bax；bcl-2；Shikonion

2013-09-09