王紅崗 魯明霞 浙江省金華市人民醫(yī)院 金華 321000

紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)肺纖維化模型大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)的影響

王紅崗 魯明霞 浙江省金華市人民醫(yī)院 金華 321000

目的觀察紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)肺間質(zhì)纖維化模型大鼠轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）表達(dá)的影響。方法120只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、強(qiáng)的松組和紫杉醇低、中、高劑量組，每組20只。通過氣管內(nèi)注射博萊霉素建立肺纖維化模型，靜脈給予紫杉醇脂質(zhì)體，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)TGF-β1含量，探討紫杉醇脂質(zhì)體影響TGF-β1的作用機(jī)制。結(jié)果實(shí)驗(yàn)第7、14、21、28天紫杉醇低、中、高劑量組TGF-β1含量均低于模型組（P＜0.05）；第7、14、21、28天紫杉醇高劑量組TGF-β1含量低于強(qiáng)的松組（P＜0.05）。結(jié)論紫杉醇脂質(zhì)體可能通過調(diào)節(jié)肺間質(zhì)纖維化模型大鼠肺組織TGF-β1含量，防止肺纖維化形成。

大鼠；肺纖維化；紫杉醇；脂質(zhì)體；TGF-β1

肺間質(zhì)纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是呼吸系統(tǒng)疾病中的一個(gè)重要的病理改變，是指由多種原因引起的一組異質(zhì)性下呼吸道彌漫性炎癥性疾病[1]，癥狀出現(xiàn)后5年存活率為30%～50%[2]。目前，針對(duì)肺纖維化機(jī)制的研究大多集中在對(duì)效應(yīng)細(xì)胞、細(xì)胞因子及其相關(guān)基因調(diào)控的研究[3]。以紫杉醇為代表的抗增殖藥物已成為預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的研究熱點(diǎn)，但至今尚無對(duì)于肺纖維化的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)建立博萊霉素A5誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，觀察紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)的影響，探討其對(duì)肺纖維化轉(zhuǎn)歸的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng) 物 SPF級(jí)雄性3～4周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠（180～200g），120只，浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK〔（浙）2007-0026）〕。所有大鼠飼養(yǎng)于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物房室溫16～22℃，濕度50%～70%。

1.2藥物及試劑 博萊霉素A5（批號(hào)060201，天津太河制藥有限公司）；注射用紫杉醇脂質(zhì)體（批號(hào)051104，南京思科藥業(yè)有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）試劑盒（批號(hào)013218，上海西唐生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組 120只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取20只設(shè)為空白對(duì)照組，另100只進(jìn)行造模，造模后再隨機(jī)分為模型組、強(qiáng)的松組及紫杉醇低、中、高劑量組，每組20只。

2.2造模及給藥 ①麻醉：按40mg/kg計(jì)算，用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉。②頸前皮膚75%酒精消毒，沿頸前正中切開約2cm大小的切口，逐層鈍性分離暴露氣管，然后用1mL注射器抽取博萊霉素A5溶液，沿氣管軟骨之間斜向下刺入并迅速注射博萊霉素A5溶液5mg/kg，立即將大鼠直立，緩慢搖動(dòng)數(shù)10s，立即消毒，縫合。③給藥：空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)；模型組24h后每天尾靜脈注射生理鹽水4mL/kg。強(qiáng)的松組24h后隔天尾靜脈射強(qiáng)的松溶液20mg/kg。紫杉醇低、中、高劑量組24h后于第1、14、21天分別尾靜脈注射紫杉醇液1、2、4mg/kg。

2.3標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)第7、14、21、28天各組隨機(jī)抽取5只大鼠摘眼球取血，后行頸椎脫臼處死，分離出肺，取左肺上葉和右肺上葉，左肺上葉拍照后置于10%中性福爾馬林溶液中浸泡固定，經(jīng)脫水，石蠟包埋切片，按常規(guī)行HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)分析。右肺上葉采用ELISA法測(cè)定大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）表達(dá)量，按照試劑盒操作。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，采用單因素方差分析以及LSD-t檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

空白組大鼠正常生長，無死亡大鼠；模型組死亡4只，強(qiáng)的松組死亡2只；紫杉醇低、中、高劑量組大鼠分別死亡2、3、1只。死亡大鼠均進(jìn)行肺組織分離，取左肺上葉用于進(jìn)行病理組織學(xué)分析。與空白對(duì)照組比較，模型組第7、14、21、28天TGF-β1表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；紫杉醇低、中、高劑量組第7、14、21、28天TGF-β1表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05）；紫杉醇低、中劑量組第7、14、21、28天TGF-β1表達(dá)量與強(qiáng)的松組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），紫杉醇高劑量組第7、14、21、28天TGF-β1表達(dá)量顯著低于強(qiáng)的松組（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)量比較（） ng/mL

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)量比較（） ng/mL

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與強(qiáng)的松組比較，▲P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組強(qiáng)的松組紫杉醇低劑量組紫杉醇中劑量組紫杉醇高劑量組n/只20 16 18 18 17 19 7d 0.065±0.044 0.237±0.041* 0.131±0.068 0.173±0.003△0.178±0.048△0.074±0.014△▲14d 0.109±0.018 0.229±0.043* 0.145±0.024 0.152±0.031△0.173±0.009△0.109±0.023△▲21d 0.073±0.006 0.266±0.045* 0.191±0.079 0.131±0.010△0.194±0.008△0.072±0.017△▲28d 0.081±0.021 0.269±0.067* 0.131±0.051 0.104±0.091△0.102±0.012△0.080±0.003△▲

4 討論

自Snider首次用博萊霉素A5制模成功以來，采用不同動(dòng)物及不同方式建立的肺纖維化模型逐漸增多，其中經(jīng)支氣管給藥已是國內(nèi)外公認(rèn)的成熟方法，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4]方法采用博菜霉素氣管內(nèi)滴注造模，其優(yōu)點(diǎn)是方法可靠、給藥劑量小、容易掌握。

在眾多致纖維化細(xì)胞因子中，TGF-β1被公認(rèn)是最重要的調(diào)控因子[5]。有研究表明，TGF-β1mRNA在肺纖維化大鼠肺組織中明顯升高[6]。TGF-β1具有多種生物活性，可促進(jìn)膠原蛋白的形成和沉積，引起細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，并抑制其降解[7]。TGF-β1的肺內(nèi)高濃度會(huì)直接導(dǎo)致肺組織細(xì)胞外基質(zhì)沉積的明顯增加[8]。此外，TGF-β1在炎癥部位活性增強(qiáng)，在多個(gè)環(huán)節(jié)促進(jìn)炎癥發(fā)展，使成纖維細(xì)胞增殖，在細(xì)胞的生長、分化、凋亡、遷移、細(xì)胞黏附、免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞外基質(zhì)合成的調(diào)節(jié)中具有重要作用[9]。因此，很多研究通過阻斷TGF-β1的表達(dá)治療肺間質(zhì)纖維化。有研究顯示[10]，用TGF-β1抗體或抗血清可以明顯減輕博來霉素誘導(dǎo)的鼠肺纖維化。Nakao等[11]在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型氣管內(nèi)注入帶有Smad7（TGF-β1信號(hào)拮抗劑）cDNA的腺病毒，結(jié)果表明，Ⅰ型前膠原RNA表達(dá)受抑制，羥脯氨酸的含量降低，沒有形成形態(tài)學(xué)上的纖維化改變。

紫杉醇已經(jīng)廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤化療方案中，普通紫杉醇中聚氧乙基蓖麻油在體內(nèi)降解時(shí)釋放組胺，可導(dǎo)致不同程度的變態(tài)反應(yīng)，亦可引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)顆粒釋放及脫髓鞘改變，加重紫杉醇的外周神經(jīng)毒性，限制了其臨床應(yīng)用。紫杉醇脂質(zhì)體由于制劑中不加入聚氧乙基蓖麻油，避免了過敏反應(yīng)及超敏反應(yīng)，減輕了不良反應(yīng)，明顯提高生物體對(duì)紫杉醇的耐受性，且由于脂質(zhì)體的靶向、滲透等作用[12]，使得紫杉醇脂質(zhì)體臨床療效明顯提高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫杉醇脂質(zhì)體可通過降低肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織TGF-β1含量，起到抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，促進(jìn)基質(zhì)蛋白受體的產(chǎn)生，減少基質(zhì)降解酶以及增加降解抑制劑的合成，進(jìn)而抑制肺組織彈性纖維鈣化，但確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］候顯明，于潤江.間質(zhì)性肺病學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：40.

［2］Rogliani P，Mura M，Assunta Porretta M，et al.New perspectives in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Ther Adv Respir Dis，2008，2（2）：75-93.

［3］徐曉峰，王辰，代華平，等.大鼠肺纖維化過程中轉(zhuǎn)化生長因子B1及其受體的同相表達(dá)［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25（9）：550-551.

［4］齊曼古麗·吾守爾，夏宇，巴哈爾古麗·米吉提，等.博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立方法及比較［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（6）：495-498.

［5］楊雅茹，黃艷，李俊.TGF-β1介導(dǎo)的Smads與ERK通路在肺纖維化中的作用及相互關(guān)系［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（5）：561-563.

［6］Jiang HY，Wek RC.Phosphorylation of the α-subunit of the eukaryotie initiation factor-2（elF2α）reduces protein synthesis and enhances apoptosis in response to proteasome inhibition［J］.J Biol Chem，2005，280（14）：14189，14202.

［7］Cutroneo KR，White SL，Phan SH，et al.Therapies for bleomycin induced lung firbrosis though regulation of TGF-betal induced collagen gene expression［J］.J Cell Physiol，2007，211：585-589.

［8］Minagawa S，Araya J，Numata T，et al.Accelerated epithelial cell senescence in IPF and the Inhibitory role of SIRT6 in TGF-β1 induced senescence of human bronchial epithelialcells［J］.Am J Cell Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，300（3）：391-401.

［9］Yan X，Liu Z，Chen Y.Regulation of TGF-beta signaling by Smad7［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2009，41：263-272.

［10］Wang Q，Wang Y，Hyde DM，et al.Reduction of bleomycin induced lung fibrosis by transforming growth factorβsoluble receptor in hamsters［J］.Thorax，2000，54（90）：805-812.

［11］Nakao A，F(xiàn)ujii M，Matsumura R，et al.Transient gene transfer and expression of Smad7 prevents bleomycin induced lung fibrosis in mice［J］.J Clin Invest，2001，104（1）：5-11.

［12］吳坤，陳珊珊，溫明玲，等.紫杉醇脂質(zhì)體與紫杉醇在巨塊型宮頸癌新輔助化療中的臨床對(duì)照研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（12）：1577.

Effect of Paclitaxel Liposome on the Expression of Transforming Growth Factor-β1 in Pulmonary Fibrosis Rats

WANG Honggang,LU Mingxia.Zhejiang Jinhua Municipal People's Hospital,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the influence of paclitaxel liposome on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）in rats model of pulmonary fibrosis.MethodsOne hundred and twenty SD rats were randomly divided into control group,model group,prednisone group,and paclitaxel liposome groups（n=20 in each group）.The model of pulmonary fibrosis was induced by intratracheal injection of bleomycinum.Paclitaxel liposome was given intravenously.The concentration of TGF-β1 was determined by ELISA.ResultsOn day 7,14,21,and 28,the concentration of TGF-β1 in various doses of paclitaxel liposome groups was lower than that of model group（P＜0.05）.On day 7,14,21,and 28,the concentration of TGF-β1 in high-dose paclitaxel liposome group was lower than that of prednisone group（P＜0.05）.ConclusionPaclitaxel liposome may prevent pulmonary fibrosis by down-regulating TGF-β1 in rats.

rats；pulmonary fibrosis；paclitaxel；liposome

2013-12-04