竺平暉 浙江省舟山市普陀區(qū)人民醫(yī)院藥劑科 舟山 316100

花椒多酚類化合物對腦卒中后抑郁大鼠腦組織NE、5-HT及MAO的影響

竺平暉 浙江省舟山市普陀區(qū)人民醫(yī)院藥劑科 舟山 316100

目的探討花椒多酚類化合物總提取物（ZPPC）抗腦卒中后抑郁作用機制。方法建立腦卒中后抑郁大鼠模型，酶聯免疫法檢測ZPPC、氟西汀對受試大鼠腦組織去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）含量的影響；采用熒光分光光度法測定ZPPC和嗎氯貝胺對受試大鼠腦內單胺氧化酶（MAO）活性的影響。結果與空白對照組比較，模型組NE、5-HT水平顯著降低（P＜0.05），ZPPC高劑量組（200mg/kg）和氟西汀組與模型組比較，NE、5-HT水平均有顯著性升高（P＜0.05）；ZPPC中、高劑量組（100mg/kg和200mg/kg）還明顯抑制大鼠腦組織MAO-A活性（P＜0.05）。結論ZPPC組能顯著提高腦卒中后抑郁大鼠腦組織NE、5-HT水平，其作用機制可能與抑制腦組織MAO-A活性有關。

大鼠；腦卒中后抑郁；花椒多酚類化合物；NE；5-HT；MAO

腦卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是腦卒中后常見的并發(fā)癥，臨床發(fā)病率為20%～50%。抑郁癥可影響患者原發(fā)疾病的康復和轉歸，并增加腦血管病患者的病死率[1]。PSD的病因非常復雜，實驗研究發(fā)現，PSD的發(fā)生與神經生物學有關，即腦內單胺類神經遞質的代謝紊亂。目前的研究集中在5-羥色胺能神經傳遞通路的改變上，研究發(fā)現，患者外周血去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）含量減少[2]，這可能是PSD發(fā)病的病理生理基礎。花椒為蕓香科植物青椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.Et Zucc.或花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮，味辛，性溫，小毒，具有“溫中止痛，驅蟲，外用燥濕，殺蟲止癢”的功效[3]，其主要化學成分有生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、揮發(fā)油和脂肪酸等。研究表明[4]，花椒多酚類化合物總提取物（ZPPC）急性給藥在小鼠行為絕望模型中顯示出明顯的抗抑郁作用。本研究通過建立卒中后抑郁動物模型，采用酶聯免疫法觀察ZPPC對模型大鼠腦組織NE、5-HT水平的影響，熒光分光光度法測定ZPPC對受試大鼠腦內單胺氧化酶（MAO）活性的影響，從而為臨床預防腦卒中后抑郁提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1動 物 雄性SD大鼠105只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號SCXK（滬）2012-0002，二級，體質量＞250g。每籠5只，室溫（23±1）℃，濕度（50±10）%，自然光照，自由攝食飲水。

1.2藥品與試劑 花椒自備。粉碎，丙酮-水溶液（7：3）浸提，減壓除去浸提液中丙酮，然后過濾殘留水液，將濾液經醋酸乙酯萃取分離，脫水干燥，得到花椒多酚類化合物總粗提取物（ZPPC），得率為0.033%。ZPPC為黃棕色粉末，實驗前用雙蒸水配成所需濃度。氟西?。好绹Y來公司。二氫溴犬脲胺、4-氫喹啉、司立吉林、氯吉林、嗎氯貝胺均購自中國藥品生物制品鑒定所?？垢腥舅帲呵嗝顾亍?-HT試劑盒：上海達豪生物科技有限公司。NE試劑盒：上海富眾生物科技發(fā)展有限公司。甲醛（分析級）、乙醚（分析純）、冰乙酸：無錫市晶科化工有限公司。

1.3儀 器 DZKW電熱恒溫水浴鍋：天津市精科材料試驗機廠。FSH-Ⅱ高速電動勻漿器：江蘇金壇實驗儀器廠。BIO-RAD550全自動酶標儀：美國伯樂。BS110S分析天平：北京塞多斯儀器公司。TGL-16GA冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠。R-5000熒光分光光度計：日本島津公司。

2 實驗方法

2.1動物分組 105只健康SD大鼠，隨機分為：①雙側頸總動脈結扎、行為限制+ZPPC高、中、低組（ZPPC組）；②雙側頸總動脈結扎、行為限制+氟西汀組（氟西汀組）；③嗎氯貝胺（嗎氯貝胺組，單胺氧化酶活性測試）；④單純雙側頸總動脈結扎、行為限制組（模型組）；⑤假手術組（空白對照組）。

2.2模型制備 腦卒中模型參照劉匯波等[5]造模法制備。腦卒中后抑郁大鼠模型的制備[6]：將成功達到腦缺血模型的大鼠，連續(xù)7天，每天10：00～16：00任取時間限制在特制的觀察籠中，予以2h的行為限制。如大鼠表現為運動活動性明顯降低、興趣缺乏、進取性降低、易絕望等特點則為造模成功。

2.3給藥方法 模型制備成功后開始給藥，按照正常成人和大鼠每千克體質量等效劑量換算系數，計算ZPPC高中低組每天給藥劑量相當于含花椒多酚類化合物總提取物藥量分別為200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg，制為藥液1.5mL灌胃，1天1次，給藥3周。氟西汀組給予氟西汀膠囊水溶液灌胃，按2.06mg/（kg·d）給藥，1天1次，給藥3周。嗎氯貝胺組測試前60min按20mg/kg灌胃給藥；模型組及假手術組予生理鹽水1.5mL灌胃，1天1次，給藥3周。

2.4NE、5-HT含量測定 各組于3周后處死大鼠，取出腦海馬區(qū)部分組織，稱重后置入1mL玻璃組織勻漿器中，加入預冷的0.1%高氯酸400mL，冰浴上下轉動8min，充分研磨使組織勻漿化后，將組織勻漿液倒入離心管內，置離心機內以（4℃）10 000×g離心15min，吸取上清液，用0.1%高氯酸溶液定容至0.5mL。大鼠腦組織中NE、5-HT的含量測定按照試劑盒說明書進行。

2.5單胺氧化酶活性測定[7]分離出部分腦組織，稱重后加入4mL冰冷磷酸緩沖液（pH7.8，0.05mol/L）制成勻漿液，在2.5mL磷酸緩沖液中加入20%曲通0.4mL和組織勻漿液0.2mL，溶液混合后38℃預孵育10min，在反應液中加入30μL 2.19mmol/L底物，37℃孵育30min，反應液中加入0.2mL高氯酸溶液（5mol/ L）中止反應，冷卻并離心10min；取0.5mL上清液，加入1mol/L氫氧化鈉溶液2.5mL。通過熒光分光光度計在激發(fā)光318nm、發(fā)射光380nm處測定產物4-氫喹啉的熒光強度。單胺氧化酶活性以nmol/30min/mg protein表示。采用Bradford法[8]測定蛋白含量。

2.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0軟件，計量資料以（） 表示，進行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間差異采用Dunnrtt’s t-test。

3 實驗結果

3.1各組大鼠腦組織NE、5-HT含量比較 與空白對照組比較，模型組NE、5-HT水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，ZPPC低、中、高組NE、5-HT水平上升趨勢明顯，其中ZPPC高劑量組NE、5-HT與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），此結果與陽性對照藥組氟西汀組的結果趨于一致。見表1。

表1 各組大鼠腦組織NE、5-HT含量比較（） ng/mL

表1 各組大鼠腦組織NE、5-HT含量比較（） ng/mL

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

3.2各組大鼠腦組織MAO活性比較 與空白對照組比較，模型組大鼠MAO-A活性有升高趨勢，而MAO-B活性有一定的抑制，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，ZPPC低、中、高劑量組大鼠MAO-A活性顯示出梯度抑制，且ZPPC中（100mg/kg）、高（200mg/kg）劑量組MAO-A活性抑制差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ZPPC各劑量組對MAOB的活性無明顯影響（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織MAO活性比較（）nmol/30min/mg protein

表2 各組大鼠腦組織MAO活性比較（）nmol/30min/mg protein

注：與模型組比較，△P＜0.05；與ZPPC中劑量組比較，*P＜0.05

組別空白對照組模型組ZPPC低劑量組ZPPC中劑量組ZPPC高劑量組嗎氯貝胺組劑量/（mg/kg）00 50.00 100.00 200.00 20.00 n/只15 15 15 15 15 15 MAO-A 65.2±3.3 69.3±3.0 60.8±3.6 42.6±3.3△29.5±2.5△* 22.1±1.5△MAO-B 162.5±6.2 159.6±7.3 160.7±8.5 162.6±6.7 158.6±7.7 160.5±8.3

4 討論

目前認為PSD的發(fā)病機制主要有兩種，一種是生物學機制，認為卒中直接損傷了與情緒有關的神經環(huán)路，影響5-羥色胺能和去甲腎上腺素能神經元及其通路，導致兩種遞質水平降低而引起抑郁[9]；另一種是社會心理學機制，認為卒中后的心理應激障礙是PSD的主要原因。研究表明[10-11]，單胺能遞質環(huán)路在抑郁的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究亦發(fā)現模型組大鼠NE和5-HT含量均低于空白對照組（P＜0.05），表明卒中后抑郁模型大鼠腦組織NE和5-HT含量水平降低。而ZPPC高劑量組（200mg/kg）和氟西汀組可明顯提高模型大鼠腦組織NE和5-HT含量水平，表明ZPPC對卒中后抑郁大鼠腦內單胺遞質降低有改善作用，這可能是其治療PSD的機制之一。

有研究表明[12]，單胺氧化酶抑制劑可引起單胺類神經遞質在神經末梢的儲存和釋放增加，從而提高單胺能神經的活性，改善情緒。單胺氧化酶根據底物的特異性和對抑制劑的敏感性分為A、B兩類。MAO-A被低濃度的氯吉林抑制，主要氧化NE和5-HT；而MAO-B的特異性底物為苯乙胺，選擇性的酶抑制劑為司來吉林，主要影響腦內多巴胺（DA）的代謝。嗎氯貝胺作為選擇性單胺氧化酶抑制劑的代表藥，可選擇性作用于MAO-A，而對MAO-B型作用短暫而輕微。實驗結果顯示，與模型組比較，腦卒中后抑郁大鼠在給予ZPPC低、中、高劑量處理后，MAO-A活性顯示出梯度抑制，且在ZPPC100mg/kg和200mg/kg劑量組MAO-A活性抑制差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這也驗證了ZPPC急性給藥結果[4]。ZPPC在行為絕望模型中呈現出明顯的抗抑郁作用，其作用機制可能通過抑制腦內單胺氧化酶活性有關。而ZPPC各劑量組對MAO-B的活性無明顯影響（P＞0.05），這可能與ZPPC特異性作用于MAO-A有關，其確切的抗卒中后抑郁機制需進一步研究。

［1］劉永珍，龍潔.卒中后抑郁狀態(tài)對預后的影響及治療進展［J］.國外醫(yī)學腦血管分冊，2001，9（4）：245-247.

［2］許晶，孫玉華.急性腦卒中后抑郁血清單胺類遞質的變化［J］.中國康復理論與實踐，2003，9（3）：153-155.

［3］Ling ZQ，Wei JG，Cheng BH，et al.Preliminary research for the efficacy of pepper［J］.Journal of Shaanxi College of Traditional Chinese Medicine，2008，31（4）：73-76.

［4］吳煜，項新新.花椒多酚類化合物急性給藥的抗抑郁作用及機制研究［J］.海峽藥學，2010，22（11）：33-35.

［5］劉匯波，葉翠飛，李斌，等.雙側頸總動脈結扎對大鼠學習記憶功能和海馬組織形態(tài)學的影響［J］.基礎醫(yī)學與臨床，1998，18（4）：54-57.

［6］襲濤，陳眉，代建峰，等.腦卒中后抑郁癥動物模型的建立

和評價［J］.中國行為醫(yī)學科學，2006，15（1）：12-13.

［7］Krajl M.A rapid microfluorometric determination of monoamine oxidase［J］.Biochem Pharmacol，1965，14（11）：1683-1686.

［8］Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72（1-2）：248-254.

［9］Starkstein SE，Robinson RG，Price TR.Comparison of patients with and without poststroke major depression matched for size and location of lesion［J］.Arch Gen Psychiatry，1988，45（3）：247.

［10］呂路線，宋景貴，盧紅，等.卒中后抑郁狀態(tài)患者的血漿、腦脊液單胺類神經遞質測定［J］.中華精神科雜志，2000，33（1）：29.

［11］許晶，孫玉華.急性腦卒中后抑郁血清單胺遞質的變化［J］.中國康復理論與實踐，2003，9（3）：153.

［12］Dar A，Khatoon S.Behavioral and biochemical studies of dichloromethane fraction from the Areca catechu nut［J］. Pharmacol Biochem Behav，2000，65（1）：1-6.

Influence of Polyphenol Extract from Zanthoxylum Bungeanum Maxim.on Norepinephrine,5-hydroxytryptamine and Monoamine Oxidase in Brain Tissue of Rats With Post-Stroke Depression

ZHU Pinghui. Department of Pharmacy,Zhoushan Putuo People's Hospital,Zhoushan(316100),China

ObjectiveTo explore the mechanism of polyphenol extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim.（ZPPC）on treating post-stroke depression.MethodsPost-stroke depression model of rat was established.ELISA was used to detect the influence of ZPPC and fluoxetine on norepinephrine（NE）and 5-hydroxytryptamine（5-HT）contents in brain tissue and the monoamine oxidase（MAO）activity in rats brain was determined by fluorescence spectrophotometry.ResultsThe levels of NE and 5-HT in brain tissue was significantly lower in model group as compared with control group（P＜0.05）,but dramatically elevated after treatment with high-dose ZPPC（200mg/kg）and fluoxetine（P＜0.05）.The activity of MAO in rats brain was inhibited by intervention of ZPPC with 100 and 200 mg/kg as compared with model group（P＜0.05）.ConclusionZPPC can upregulate NE and 5-HT in brain tissue of rats with post-stroke depression and the underlying mechanism may involve inhibition of MAO activity.

rats；post-stroke depression；polyphenols extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim；norepinephrine；5-hydroxytryptamine；monoamine oxidase

2013-10-22