奚淑芳王群江潘智敏端禮榮

1浙江蕭山醫(yī)院 杭州 311202 2浙江省人民醫(yī)院

3浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 4江蘇大學醫(yī)學院預防醫(yī)學系

原兒茶酸防護百草枯致胎鼠中腦細胞損傷實驗研究

奚淑芳1王群江2潘智敏3端禮榮4

1浙江蕭山醫(yī)院 杭州 311202 2浙江省人民醫(yī)院

3浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 4江蘇大學醫(yī)學院預防醫(yī)學系

目的觀察原兒茶酸（PCA）對百草枯（PQ）所致胎鼠中腦神經(jīng)細胞損傷的保護作用。方法取胚胎大鼠進行中腦神經(jīng)細胞分離培養(yǎng)，隨機分為空白對照組、陽性對照組、PQ組及PCA高、低濃度組（100μmol/L和50μmol/L），分別給予神經(jīng)生長因子（NGF）、PQ和PCA進行配組干預，接種第6天除空白對照組，另四組均加入PQ終濃度為800μmol/L。接種第7天觀察細胞生長狀況。四唑鹽（MTT）比色法檢測神經(jīng)細胞活性，抗酪氨酸羥化酶（TH）免疫熒光染色法測定多巴胺（DA）能神經(jīng)元數(shù)量；TH免疫熒光染色比較各組陽性神經(jīng)元數(shù)目及細胞核、軸突的變化情況。結果與空白對照組、陽性對照組、PCA組比較，PQ組細胞核固縮、破裂，細胞凋亡率升高；PCA高、低濃度預處理后，細胞存活率增加（P＜0.05），細胞軸突損傷減少，細胞凋亡率降低，且具有量-效關系。結論PCA對PQ誘導的中腦神經(jīng)細胞凋亡具有抑制作用，該作用有濃度依賴性，提示PCA對胎鼠中腦神經(jīng)細胞及DA能神經(jīng)元有一定的保護作用。

胎鼠；中腦細胞損傷；原兒茶酸；百草枯；酪氨酸羥化酶

原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA，即3，4-二羥基苯甲酸），是一種天然存在于許多果蔬中的酚酸類物質(zhì)，也是許多中藥的有效活性成分。近年研究發(fā)現(xiàn)，PCA具有抗氧化、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、介導腫瘤細胞凋亡等許多新的藥理作用[1-2]，具有較強的清除超氧自由基和羥自由基能力[3]，PCA可抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡，抑制1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）介導的PC12細胞損傷[4-6]。本實驗觀察PCA對百草枯（paraquat，PQ）損傷后胎鼠中腦細胞及多巴胺能神經(jīng)細胞的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 孕15天SD大鼠15只，體質(zhì)量（300±10）g；實驗動物合格證號：SYXK（蘇）2008-0024，由江蘇大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2藥物及試劑 原兒茶酸：中國藥品生物制品鑒定所（規(guī)格：50mg）；酪氨酸羥化酶一抗（小鼠抗大鼠）、PQ、DMEM細胞培養(yǎng)基：Sigma公司；神經(jīng)生長因子（NGF）：Promage公司；熒光（FITC）試劑盒：武漢博士德公司；3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）：Gibco公司；多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）1：250：Sigma公司分裝；HEPES緩沖溶液：Fetal Bovine Serum（FBS USA）。

1.3方 法

1.3.1胎鼠中腦神經(jīng)細胞培養(yǎng) 取孕15天SD大鼠，均脫頸致死，75%乙醇浸泡5min，超凈臺內(nèi)解剖，仔細剪開子宮，取出胚胎，解剖顯微鏡下剝出腦組織，精細解剖鑷分離出中腦黑質(zhì)部分，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶（Trypsin 1:250），37℃5%CO2培養(yǎng)箱中溫育25min，培養(yǎng)液中放置10min，終止胰蛋白酶作用，800rpm離心5min，吸棄上懸液，加培養(yǎng)液；火焰刨光的直頭滴管吹打10次，靜置沉淀，吸取上懸液，調(diào)整細胞濃度，按照每孔2×105、1×105細胞分種于24孔和96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2藥物處理 接種的標本隨機分為空白對照組、陽性對照組、PQ組和PCA高、低濃度組。接種后第3天細胞更換新鮮培養(yǎng)液，PCA組換液時培養(yǎng)液中加PCA（高濃度組終濃度為100μmol/L，低濃度組終濃度為50μmol/L），陽性對照組加入NGF（終濃度50μg/L），對照組、PQ組加入正常細胞培養(yǎng)液；接種第6天再換液1次，各組所加藥物同上。PQ組、陽性對照組、PCA兩組均加入用二甲基亞砜（DMSO，終濃度為0.1%）稀釋液稀釋的PQ（終濃度為800μmol/ L）。

1.3.3神經(jīng)細胞活性測定 采用四唑鹽（MTT）比色法。MTT粉劑溶于雙蒸水，配制濃度為5mg/mL MTT溶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將細胞培養(yǎng)至第7天，在同一批培養(yǎng)于96孔的細胞中加入配制好的MTT每孔10μL，將其置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，緩慢吸去上清后每孔加入100μL的二甲基亞砜（DMSO）作用10min，使之充分溶解。采用檢測波長570nm的Bio-RAD680型酶標儀上測細胞吸光值（A值）。

1.3.4多巴胺（DA）能神經(jīng)元計數(shù) 采用TH免疫熒光染色，95%酒精固定細胞20min，0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，然后滴加抗體稀釋液稀釋的TH一抗（小鼠抗大鼠，1：3000稀釋），置37℃濕盒中30min，0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，除去非特異性吸附的抗體。滴加熒光標記的二抗（羊抗小鼠IgG-FITC），置37℃濕盒中30min，0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，熒光封片劑封片，揩干玻片周圍水分，熒光顯微鏡高倍（40×）采圖觀察，計數(shù)陽性細胞。

1.4統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用（） 表示，應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（先檢驗樣本的方差齊性，對不滿足齊性的資料進行非參數(shù)秩和檢驗）。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1細胞形態(tài)學觀察 TH免疫熒光染色后空白對照組細胞為正常活性狀態(tài),細胞核邊緣光滑完整,均勻淡染；PQ組大多數(shù)細胞體皺縮或腫脹，細胞核固縮、破裂，細胞表面不光滑，軸突呈串珠樣腫脹或斷裂甚至消失，軸突的數(shù)目及長度明顯減少，網(wǎng)狀交織的突起變得稀疏；PCA組和陽性對照組神經(jīng)細胞胞體呈圓形、梭形或多角形，突起有延長、分支及細胞數(shù)目較PQ組多，見圖1（封二）。

2.2神經(jīng)細胞計數(shù) TH免疫熒光染色后，高倍熒光顯微鏡下對顯示陽性反應的神經(jīng)細胞進行計數(shù)，各組隨機選取9孔，每孔隨機計算5個視野。PCA兩個濃度組均可明顯抑制PQ引起的中腦神經(jīng)多巴胺能神經(jīng)細胞存活率的降低,與PQ組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且兩個濃度組間差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。表明PCA可對抗PQ誘導的中腦多巴胺能神經(jīng)細胞毒性，此作用可能有濃度依賴性。

2.3細胞活性檢測 MTT比色試驗，采用檢測波長570nm，參考波長630nm。每組隨機檢測25孔，PCA兩濃度組和陽性對照組細胞細胞吸光度值（A值）明顯高于PQ組細胞（P＜0.05），且PCA組2個濃度組之間A值差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組胎鼠中腦細胞A值及TH陽性細胞數(shù)比較（）

表1 各組胎鼠中腦細胞A值及TH陽性細胞數(shù)比較（）

注：與PQ組比較，*P＜0.05；與PCA低濃度組比較，△P＜0.05

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3 討論

原兒茶酸是一種酚酸類物質(zhì)，是很多中藥（如益智仁、丹參、芙蓉等）的有效活性成分，具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、抑菌、鎮(zhèn)痛等多方面藥理活性。研究表明，原兒茶酸還具有抗氧化[4]、促進皮質(zhì)神經(jīng)元存活及突起生長[7]等作用，對神經(jīng)損傷具有保護作用[8]。酚酸類化合物分子中的酚羥基是優(yōu)良的氫（或中子）的給予體，可以與過氧自由基、羥自由基等自由基結合，生成活性很弱的醌自由基結構，該結構不再具有奪取氫原子所需的能量，終止了自由基鏈式反應，從而清除自由基，起到抗氧化作用[9]。百草枯是一種除草劑，其通過增加氧化應激對細胞的損傷導致中腦多巴胺能神經(jīng)細胞的變性、死亡，現(xiàn)已被廣泛應用于帕金森病模型的制備[10]。

神經(jīng)生長因子是一種能促進中樞和外周神經(jīng)分化、生長和存活的活性蛋白質(zhì)，它在神經(jīng)細胞的發(fā)育和正常的生理功能維持中起著重要作用[11]。因此，我們選用NGF為陽性對照藥物。本實驗結果顯示，PQ損傷后細胞生長明顯抑制，細胞核固縮、破裂，軸突斷裂，經(jīng)過PCA和NGF處理后細胞生長狀況較未處理者明顯改善，軸突延長增多，細胞數(shù)目明顯多于PQ組。PCA組及陽性對照組細胞活性（A值）及TH陽性細胞數(shù)均顯著高于PQ組（P＜0.05）；PCA高濃度組A值及TH陽性細胞數(shù)均顯著高于低濃度組，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示PCA可提高體外培養(yǎng)的胚胎大鼠中腦神經(jīng)細胞的活性，并可能促進DA能神經(jīng)生長，對抗其凋亡，此作用呈濃度依賴性。

［1］Guan S，Ge D，Liu TQ，et al.Protocatechuic acid promotes cell proliferation and reduces basal apoptosis in cultured neural stem cells［J］.Tox icol In Vitro，2009，23（2）：201-208.

［2］Zhang HN，An CN，Pu XP，et al.Protocatechuic acid inhibits neurotoxicity induced by MPTP in vivo［J］.Neurosci Lett，2010，474（2）：99-103.

［3］Tseng TH，Wang CJ，Kao ES，et al.Hibiscus protocatechuic acid protects against oxidative damage induced by tertbutylhydroperoxide in rat primary hepatocytes［J］.Chem.Biol Interact，1996，101（2）：137-148.

［4］Guan S，Bao YM，Jiang B，et al.Protective effect of protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla on hydrogen peroxideinduced oxidative PC12 cell death［J］.Eur J Pharmacol，2006，538（1-3）：73-79.

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［6］An LJ，Guan S，Shi GF，et al.Protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla against MPP+-induced neurotoxicity in PC12 cells［J］.Food Chem Toxicol，2006，44（3）：436-443.

［7］薛小燕，羅煥敏.原兒茶酸通過A2a受體促進皮質(zhì)神經(jīng)元存活及突起生長［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2011，25（增刊）：13.

［8］Liu YM，Jiang B，Bao YM，et al.Protocatechuic acid inhibits apoptosis by mitochondrial dysfunction in rotenone-induced PC12 cells［J］.Toxicol In Vitro，2008，22（2）：430-437.

［9］聶波，黃鋒，劉勇，等.中藥中的四個酚酸化合物的抗氧化活性研究［G］.第八屆全國中西醫(yī)結合實驗醫(yī)學研討會論文匯編.2006.

［10］張闿藝，黃小軍，黃曉峰.帕金森病環(huán)境毒素模型的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2008，14（21）：3272-3275.

［11］倪厚杰，唐洲平.神經(jīng)生長因子治療腦出血的作用機制［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2012，19（1）：58-61.

修回日期：2013-12-10

Protective Effect of Protocatechuic Acid on Paraquat-induced Mesencephalic Cell Damage in Fetal Rats

XI Shufang1,WANG Qunjiang2,PAN Zhimin3,DUAN Lirong4.1 Zhejiang Xiaoshan Hospital of Zhejiang,Hangzhou (311202),China;2 Zhejiang Provincial People's Hospital;3 First Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Medical University;4 Department of Preventive Medicine,College of medicine,Jiangsu University.

ObjectiveTo investigate the protective effect of protocatechuic acid（PCA）on paraquat（PQ）-induced midbrain neural stem cell injuries of fetal rats.MethodsThe midbrain neural stem cells of fetal rats were isolated and cultured,and then the cells were divided into control group,positive control group,PQ group,and PCA groups（100 and 50μmol/L）.On day 3,the cells were treated with nerve growth factor（NGF）,PQ and PCA to observe the growth status of cells.On day 6,except for control group,the cells in other 4 groups were treated with PQ of 800 μmol/L.MTT assay was used to detect neural cell activity and the number of dopaminergic（DA）neurons was determined with antibodies of tyrosine hydroxylase（TH）by immunofluorescence.The neural cellular morphology, counts,and axons were compared among different groups.ResultsCompared with control group,positive control group,and PCA groups,cell survival was decreased,and cell chromatin pyknosis and apoptosis was increased in PQ group（P＜0.05）;After treatment with two doses of PCA,cell survival was increased（P＜0.05）and cell axonal injury was reduced and apoptosis was decreased in a dose-effect manner.ConclusionPCA has an inhibitory effect on apoptosis of embryonic rat mesencephalic cells induced by PQ,and this effect is concentration dependent. This indicated that Tip PCA had a protective effect on primary cultured mesencephalic cells and DA neurons.

fetal rats；mesencephalic cell damage；protocatechuic acid；paraquat；tyrosine hydroxylase

2013-10-26