趙月明，任國譜

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長沙410004；2.湖南省亞華乳業(yè)控股有限公司中心實驗室長沙410004)

0 引 言

蠟樣芽孢桿菌是一種無莢膜，能運動，產(chǎn)芽孢，兼性好氧的革蘭氏陽性桿菌。蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生致吐、致腹瀉的腸毒素,人在食用被蠟樣芽胞桿菌污染的食品后,一般在8～16 h內(nèi)出現(xiàn)嘔吐或腹瀉,或兩者兼有的中毒癥狀[1]。偶爾能導(dǎo)致眼部感染，心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾病[2]。 因為蠟狀芽孢桿菌廣泛存在于土壤、空氣、水和塵埃中，所以無法避免地會污染食品[3]。原料奶的污染來源主要有奶牛的糞便、飼料，水和土壤，其次是奶罐和加工場的機械管道。產(chǎn)生腸毒素的蠟樣芽孢桿菌菌株已經(jīng)從許多種食品中分離出來,在原料乳中分離的83株菌中有85%是致腹瀉毒素陽性菌株[4]。在乳品行業(yè)，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒極可能被誤認為是乳糖不耐癥而被忽視。本文概述蠟樣芽孢桿菌的檢測方法及其在乳制品中的污染情況，為追溯其污染情況源及建立相應(yīng)防控措施提供理論依據(jù)。

1 蠟樣芽孢桿菌對乳制品的污染情況

乳制品在加工、運輸、儲存等環(huán)節(jié)均易受蠟樣芽孢桿菌污染，該菌可以通過泥土、灰塵、昆蟲、不潔用具和從業(yè)人員的手而傳播，研究表明食品中蠟樣芽孢桿菌污染程度為104CFU/mL時就會對人體造成潛在的健康威脅從而不適于消費者食用[5]，當(dāng)菌落含量超過105CFU/mL時，就有可能爆發(fā)食物中毒事件[6]。在1986～2007年發(fā)生的227起蠟樣芽孢桿菌嘔吐型食物中毒事件，有2.6%是由乳及乳制品引起的，34起腹瀉型食物中毒事件5.9%是由乳及乳制品引起的[7]，這其中不包括被誤當(dāng)做乳糖不耐癥而被忽視的。嬰幼兒免疫功能低，葉紅萍[8]曾報道1例試用嬰幼兒配方奶粉引起的腹瀉檢出蠟樣芽孢桿菌，其菌落總數(shù)為160CFU/g,遠低于105CFU/mL，亦能致病。其中有2起是嬰兒奶粉和2起利樂包包裝的椰子奶。

近年來國內(nèi)有關(guān)乳制品中蠟樣芽孢桿菌的研究和檢測主要集中在原料奶和嬰幼兒配方奶粉，其污染情況的部分研究如表1所示。

2 蠟樣芽孢桿菌的檢測方法

2.1 常規(guī)鑒定方法

傳統(tǒng)檢測方法是將分離培養(yǎng)后的可疑菌落做生化反應(yīng)試驗，溶血試驗，協(xié)同溶血試驗，動物試驗，典型運動等鑒定，被確定為蠟樣芽孢桿菌后進一步進行血清分型。目前我國常用的蠟樣芽孢桿菌的檢驗方法是國標法GB 4789.14-2003，以及行業(yè)標準SN/T 0176-1992(進出口食品蠟樣芽孢桿菌檢驗方法)和SN/T 255211-2010(乳及乳制品微生物學(xué)檢驗方法)。常規(guī)檢驗步驟為[19]：樣品→增菌→分離培養(yǎng)(并作菌數(shù)測定)、分離純化→革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應(yīng)試驗→腸毒素檢查。這種方法費時、費力，而且需要較長時間進行選擇性增菌過程[20]。

目前檢測方法中常用的選擇性培養(yǎng)基主要有蠟樣芽孢桿菌選擇瓊脂(PEMBA)、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基 (MYP)，顯色培養(yǎng)基主要是BCM。PEMBA已經(jīng)是國際化標準組織(ISO)公認的檢驗蠟樣芽孢桿菌的選擇性培養(yǎng)基，主要用于臨床樣本。MYP廣泛用于蠟樣芽孢桿菌的分離和計數(shù)。BCM和MYP相比菌落技術(shù)和分離更容易，有較高選擇性，能形成離散的不連在一起的菌落[21]。

表1 乳制品中蠟樣芽孢桿菌污染情況

2.2 快速檢測方法

2.2.1 PCR法

(1)普通PCR方法

Tsen等[22]設(shè)計了16S核糖體RNA的引物，以此為基礎(chǔ)建立PCR來定量檢測。王振國等[23]通過擴增致病性蠟樣芽孢桿菌的hblA基因?qū)崿F(xiàn)對蠟樣芽孢桿菌的快速檢測。

ELSE M F等[24]建立了實時PCR檢測蠟樣芽孢桿菌的方法；王振國等[25]利用SYBR Green I染料能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光的特點，開發(fā)出一種用來檢測致病性蠟樣芽孢桿菌的實時PCR方法；王紅等[26]建立實時熒光PCR檢測蠟樣芽孢桿菌以及溶血素HBL和非溶血素NHE。

普通PCR電泳法和實時熒光PCR法比較結(jié)果如表2。

表2 普通PCR與熒光PCR比較

利用PCR技術(shù)對食品中的蠟樣芽孢桿菌的檢測較常規(guī)方法具有省時省力的特點且靈敏性較高，具有較高的實際應(yīng)用價值。但這些方法的缺點是不能特異性檢測到靶生物，不能檢測到所有的從食品中分離的蠟樣芽孢桿菌，靈敏度低。蠟樣芽孢桿菌形成的芽孢也給PCR檢測帶來了不便。多數(shù)情況下都需要將菌在適合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～15 h后，大大延長了檢測時間[27]。

與常規(guī)PCR電泳方法相比，實時熒光PCR無須電泳，與其他非致病蠟樣芽孢桿菌及其他菌株均無交叉反應(yīng)，可以直接對擴增產(chǎn)物進行檢測，縮短了檢驗時間，且可避免擴增產(chǎn)物對實驗室的污染，具有較強的應(yīng)用價值。但該法容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，對引物要求較高，檢驗成本也較高[23]。

Hikmate Abriouel等[28]用 重 復(fù) 序列引物聚合酶鏈反應(yīng) (repetitive element sequence-based PCR)和16S rDNA順序序列分析的方法來區(qū)分同源關(guān)系的蠟樣芽孢桿菌組.

Eulyoung Choo等[29]設(shè)計出多重PCR快速鑒定蠟樣芽孢桿菌的方法；蔣培余等[30]通過設(shè)計引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立多重實時PCR，檢測蠟樣芽孢桿菌16S rRNA保守區(qū)基因及其ces基因 (編碼致嘔毒素cereulide)與菌株鑒定結(jié)果的符合率為100%，ces基因檢測結(jié)果與普通PCR結(jié)果相符。李洋洋等[31]建立了同時檢測嬰幼兒奶粉中坂崎桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的多重PCR方法。

黃訓(xùn)端等[32]利用VITEK自動鑒定系統(tǒng)鑒定草莓蠟樣芽孢桿菌,與分子生物學(xué)的驗證后結(jié)果一致，表明VITEK的可靠性和準確性。趙寧等[33]針對目前原料乳中蠟樣芽孢桿菌檢測方法的繁瑣、費時、耗力，建立了一種操作簡便的快速檢測方法，采用過濾富集菌體后PCR技術(shù)來檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌。整個過程只需6 h左右即可完成，檢測靈敏度高達10 CFU/mL這種方法是對傳統(tǒng)檢測方法的有效改進，并且達到了原料乳檢測快速、準確、靈敏的要求。

2.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

齊哲[34]開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)快速檢測蠟樣芽孢桿菌的方法。該法以蠟樣芽孢桿菌溶血素基因的hblA基因的保守序列設(shè)計引物，將FTA濾膜提取DNA與LAMP法相結(jié)合，檢測蠟樣芽孢桿菌和人工污染蠟樣芽孢桿菌的消毒乳。LAMP方法檢測靈敏度高，蠟樣芽孢桿菌的檢出限為4.4 mL-1，比PCR檢測靈敏度高10倍；人工污染消毒乳中蠟樣芽孢桿菌的檢出限57 mL-1。LAMP擴增可在20 min內(nèi)完成，對消毒乳中蠟樣芽孢桿菌的檢測 (包括DNA提取、LAMP和電泳)可在2 h內(nèi)完成.該方法靈敏度高、特異性好、耗時短。

2.2.3 PCR—DHPLC法

鄭秋月等[35]應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)對食品中污染的蠟樣芽孢桿菌進行快速準確的檢測。該法是根據(jù)蠟樣芽孢桿菌gyrB特異基因序列的特點設(shè)計特異性引物，PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進行快速檢測。結(jié)果表明該方法具有很高的特異性，靈敏度高，檢出限可達10 mL-1，快速簡便。

2.2.4 微生物專用酶快速反應(yīng)系統(tǒng)的檢測技術(shù)

張淑紅等[36]利用特異性酶法鑒定致病菌的特點，設(shè)計了一種用來檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的顯色快速檢測方法。該法利用特異性酶反應(yīng)原理，設(shè)計了蠟樣芽孢桿菌顯色培養(yǎng)基(HKCB)，通過人工污染樣品和實際樣品檢驗，分析，結(jié)果表明顯色培養(yǎng)基HKCB與傳統(tǒng)平板MYP可以達到相同的檢測限和靈敏度，且具有較高的特異性。

2.2.5 免疫學(xué)方法

檢測蠟樣芽孢桿菌腸毒素的免疫學(xué)方法主要有免疫乳膠凝集試驗、反向簡介凝血試驗、反向被動乳膠凝集試驗、放射免疫法、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫測試技術(shù)及免疫印跡法等。CHEN CH等[37]報道了用蛋白印記技術(shù)(Colony Blot Immunoassay，CBI)快速檢測蠟樣芽抱桿菌的方法。

Nadine[38]等用酶聯(lián)免疫技術(shù)選擇出兩種抗蠟樣芽孢桿菌的單克隆抗體，這兩種單抗均與蠟樣芽孢桿菌活菌體反應(yīng)，且不與起芽孢反應(yīng)，并研究了聯(lián)合這兩種抗體來檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的方法，此方法檢測的最低限為102mL-1。

Chen[39]等運用免疫學(xué)方法，通過蠟樣芽孢桿菌特定的表面抗原與特異的抗體相結(jié)合，實現(xiàn)了對蠟樣芽孢桿菌快速檢測。此方法具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強的特點。

3 乳制品中蠟樣芽孢桿菌的防控措施

蠟狀芽孢桿菌污染牧場環(huán)境和生乳，既有致病性，也影響牛奶的質(zhì)量，可造成牛奶的“甜酪”和“凝結(jié)乳脂”現(xiàn)象，導(dǎo)致淡煉乳出現(xiàn)凝塊、苦味、酸味和腐敗味[40]。

要防止蠟樣芽孢桿菌污染乳制品，尤其是防止嬰幼兒奶粉的污染，預(yù)防可能危害人體健康的潛在危險產(chǎn)生，就必須從原料乳開始，對生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，可能產(chǎn)生污染的各種可能性進行分析，并制訂相應(yīng)的預(yù)防措施，建立監(jiān)測方法，將原料乳生產(chǎn)中微生物指標提前控制，尤其要控制芽孢的數(shù)量，使其危害程度降到最低。建立并嚴格執(zhí)行行之有效的HACCP(危害分析和關(guān)鍵控制點)系統(tǒng)，并把腸桿菌科作為生產(chǎn)線的衛(wèi)生指標菌。要防止蠟樣芽孢桿菌的污染，必須在乳制品加工過程中對各個環(huán)節(jié)進行嚴格消毒，同時通過適當(dāng)巴氏殺菌、超高溫殺菌或其他高溫工藝可徹底的殺滅該菌。

近年來，研究者們對于蠟樣芽孢桿菌的抑制作用做了很多研究。韓永霞，殷文正[41]等研究了溫度、pH值、紫外線、固態(tài)介質(zhì)對牛乳中蠟樣芽孢桿菌生長的影響，研究表明，0℃以下和63℃以上不繁殖，65～70℃菌體易死去；耐酸堿范圍廣pH值為5～9，pH值大于10和pH值小于2時不生長；與氧氣接觸時生長更快，紫外線照射雖能抑制該菌的生長，但照射兩小時后仍能較好生長。

王忠堂，姚詠明等[42]探討了不同質(zhì)量濃度核黃素對雙歧桿菌、蠟樣芽孢桿菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)核黃素對雙歧桿菌和蠟樣芽孢桿菌生長具有促進作用,一定質(zhì)量濃度核黃素還可提高菌懸液中雙歧桿菌和蠟樣芽孢桿菌的長期存活率。

莫金觀，鄧金花等[43]比較了不同消毒劑對蠟樣芽孢桿菌的殺滅效果，結(jié)果表明，過氧乙酸和二氧化氯對蠟樣芽孢桿菌殺滅效果較好，?？捎糜趯Νh(huán)境、生產(chǎn)場地、食品用具消毒。在乳制品中可以用于車間設(shè)備管道、室內(nèi)空氣以及工作人員手和衣物的清洗和消毒。

黃現(xiàn)青，史苗苗等[44]的研究結(jié)果表明，殼聚糖、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸的最小抑菌質(zhì)量濃度分別是10，2.5，0.039 g/L，以牛奶為介質(zhì)，殼聚糖、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸的質(zhì)量濃度分別為5，0.02，0.01 g/L這一組合條件下對蠟樣芽孢桿菌抑制作用最好，對蠟樣芽孢桿菌殺菌率達83.5%。

喬支紅，程永強等[45]通過研究乳酸對3種食源性致病菌的抑菌及殺菌作用，說明了乳酸對致病菌的抑菌、殺菌作用主要是通過延長致病菌的代時及破壞正常的細胞電位達到的。乳酸對蠟樣芽孢桿菌最小抑菌質(zhì)量濃度3.6 g/L、最小殺菌質(zhì)量濃度7.2 g/L。

孟浩浩，李婷等[46]對牛乳UHT處理前后所含芽孢桿菌進行分離鑒定，結(jié)果表明超高溫瞬時殺菌可以使蠟樣芽孢桿菌完全失活，實現(xiàn)商業(yè)無菌，保證乳品質(zhì)量。

4 結(jié)束語

蠟樣芽孢桿菌作為一種條件致病菌，目前，研究者對它的污染來源、微生物特性、檢測方法以及乳制品中的污染情況等方面已做了大量研究，這對于減少蠟樣芽孢桿菌的危害具有重要的指導(dǎo)意義。但是目前乳制品生產(chǎn)過程中污染的蠟樣芽孢桿菌是由于哪個生產(chǎn)工序引起還是未知的，而且許多檢測方法和防控該菌的技術(shù)方法還處于理論研究階段。相信隨著研究的深入，防控蠟樣芽孢桿菌污染乳制品的有效措施將被推出，從而真正做到防患于未然。國家嬰幼兒配方食品食品安全標準(GB10765-2010)[47]中，對蠟樣芽孢桿菌等條件致病菌沒有明確的規(guī)定。鑒于蠟樣芽孢桿菌的致病性以及其芽孢很強的抵抗能力和繁殖能力，建議嬰幼兒配方奶粉的國家安全標準微生物限量指標中，增加蠟樣芽孢桿菌等條件致病菌指標，確保嬰幼兒乳品等食品的安全可控。

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