李建光， 張 露

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

番茄堿是番茄苷的苷元，存在于茄科植物中的甾體類糖苷生物堿，是植物產(chǎn)生的次生代謝物[1]。番茄堿具有抗腫瘤、抗炎、降低膽固醇及抗利尿的作用，同時可作用于心血管、膽堿酯酶和鈣調(diào)蛋白有關(guān)酶，還可作為抗瘧疾疫苗的免疫佐劑[2-6]。在番茄植株中，番茄苷的含量最高，而番茄苷在高溫強酸性條件下可以水解成番茄堿，降低番茄苷的毒性，提高番茄等茄科植物的食用安全性。天然植物中的番茄堿含量較低，且由于受到原料的限制，制約了番茄堿的產(chǎn)業(yè)化及在醫(yī)藥、農(nóng)藥、功能食品上的推廣應(yīng)用[7]。長期以來人們一直研究植物體內(nèi)番茄堿的生物合成，Laurila等[8]研究發(fā)現(xiàn)了番茄堿在植物體內(nèi)的一系列生物合成途徑。但是在番茄堿的合成過程中許多作用酶還不清楚，這就制約了番茄堿在體外的生物合成。

本實驗根據(jù)在高溫強酸性條件下可以使番茄苷水解成番茄堿的特性，將提取出的番茄苷粗品與濃鹽酸發(fā)生水解反應(yīng)得到番茄堿，用HPLC-MS/MS 對番茄堿進行定量分析，并采用瓊脂擴散濾紙片法研究番茄堿對大腸桿菌的抑制活性。

1 儀器與試藥

1.1儀器Agilent1200RRLC-Agilent6410串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，XDB-C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，電子天平(Sartorius BP211D，0.01 mg)，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海安亭電子儀器廠)，PHILIPS打漿機，0.22 μm一次性過濾頭(德國Dr)，潔凈工作臺(SW-CJ-IBV蘇凈集團蘇州安泰技術(shù)有限公司)。

1.2試藥新鮮青番茄：青熟期，全果翠綠色，部分果頂顯白色，藥材經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍教授鑒定為茄科(Solanaceae)番茄屬(LycopersiconMill)植物番茄的果實。番茄堿對照品(多倫多化學(xué)實驗有限公司，批號6192-62-7)，甲醇(色譜純，美國TENDA)，其余試劑均為分析純。大腸埃希氏桿菌(新疆醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供，20130428)，營養(yǎng)瓊脂(實驗室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1番茄堿的含量測定

2.1.1 HPLC-MS/MS分析條件 流動相為CH3OH-10 mmol/L-NH4Ac水溶液(含0.1%HCOOH)=60∶40，SIM，ESI(+)，XDB-C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃，進樣量3 μL，流速0.2 mL/min。干燥氣溫度350℃，干燥氣流量9 L/min，霧化氣壓力40 psi，毛細管電壓+4 000 V，源內(nèi)碎裂電壓135 V。

2.1.2 番茄堿對照品溶液的配制 精密稱定番茄堿對照品約10.00 mg，用甲醇溶解，定容于100 mL量瓶中，得番茄堿對照品儲備液，濃度為0.1 mg/mL。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用甲醇將儲備液稀釋為濃度為0.003 0、0.009 0、0.015 0、0.020 0、0.030 0 μg/mL的稀釋液，每一濃度進3針，取峰面積平均值，以對照品濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，得線性方程Y=65 990X+9.054，r=0.999 5，線性范圍為0.003 0～0.030 0 μg/mL。HPLC-MS/MS圖如圖1、2所示。

圖1 番茄堿對照品HPLC-MS/MS圖

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取番茄堿對照品溶液，濃度為0.009 0 μg/mL，分別在0、2、4、8、16、24 h不同時間點進行測定，考察峰面積的一致性，結(jié)果RSD為0.86%。

圖2 番茄堿晶體樣品HPLC-MS/MS圖

2.1.5 精密度試驗 取番茄堿對照品溶液，濃度為0.009 0 μg/mL，做日內(nèi)和每隔1天的日間精密度試驗，各進6次樣，每次進3針，計算平均峰面積，測定峰面積與出峰時間的比值，結(jié)果日內(nèi)RSD為0.48%，日間RSD為0.98%。

2.1.6 重現(xiàn)性試驗 取番茄堿對照品溶液5份，濃度為0.009 0 μg/mL，每份進3針，考察峰面積的一致性，結(jié)果RSD為0.71%。

2.1.7 加樣回收率試驗 取番茄堿樣品溶液6份，濃度為0.009 0 μg/mL，各1 mL，精密測定，分別準(zhǔn)確加入濃度分別為0.004 5、0.009 0、0.018 0 μg/mL對照品溶液各1 mL，依次加入6份樣品溶液中，測定并計算其回收率，結(jié)果番茄苷的平均回收率為97.56%(n=6)，RSD=1.74%。

2.2番茄堿粗品的制備原料為青番茄，提取溶劑為無水乙醇，溫度為60℃，浸提時間為2.5 h，料液比為1∶5，超聲處理30 min，共提取2次。提取液濃縮至無醇味，用5% NaOH調(diào)節(jié)其pH值>8，靜置過夜，離心得到沉淀物，用蒸餾水將沉淀物洗至中性，用丙酮、氯仿將沉淀物各萃取3次，用甲醇溶解沉淀，將不溶物過濾后棄去，蒸干甲醇得到番茄苷粗品。用20%乙醇溶解后經(jīng)HPD-100A大孔吸附樹脂用3 BV的蒸餾水除雜,然后用3 BV的95%乙醇洗脫,除去番茄苷粗品中的糖和部分水溶性雜質(zhì)，合并乙醇洗脫液后待用[9-10]。

將上述乙醇洗脫液旋蒸至無醇，體積為V1，加入濃鹽酸，體積為V2(V1∶V2=10∶1)，在90℃條件下水解1 h，水解完全后用5% NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值>8，用氯仿萃取3次合并氯仿液，旋轉(zhuǎn)蒸干氯仿后用無水乙醇溶解蒸發(fā)瓶上的物質(zhì)，蒸發(fā)掉約一半的乙醇后，趁熱過濾后棄去不溶物。濾液置于4 ℃冰箱1 w，過濾得到沉淀，將沉淀再溶于無水乙醇，重復(fù)上述操作即可得到番茄堿粗品。

2.3番茄堿粗品的分離純化精密稱定1.093 g番茄堿粗品，稱取在160 ℃條件下活化2 h的硅膠100 g，濕法裝柱(柱為3.5 cm×70 cm層析柱)，干法上樣。以4種流動相依次進行洗脫：(1)氯仿-甲醇(15∶1，v/v)；(2)氯仿-甲醇-28%氨水(40∶10∶1，v/v/v)；(3)氯仿-甲醇-28%氨水(90∶30∶5，v/v/v)；(4)甲醇。洗脫流速為7 mL/min，以每50 mL為一流份收集，TLC實時跟蹤番茄堿至檢不出番茄堿，停止洗脫。合并含番茄堿的流份，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，稱量，用甲醇溶解洗脫物，過濾棄去不溶物，用HPLC-MS/MS 測定濾液中番茄堿濃度，計算洗脫物中番茄堿的含量。結(jié)果由樣品峰面積計算后可知洗脫物中番茄堿的含量為69.60%。

2.4番茄堿的結(jié)晶與重結(jié)晶用適量的甲醇將洗脫物溶解，過濾并棄去不溶物，置4℃冰箱中使其緩慢結(jié)晶，待結(jié)晶完全后，使上清液傾出，用少量冷甲醇將結(jié)晶沖洗，抽濾，干燥。反復(fù)重結(jié)晶2次，將得到的晶體稱重，溶于甲醇，用HPLC-MS/MS 測定濃度，計算晶體中番茄堿的含量。結(jié)果由晶體樣品峰面積計算后可知番茄堿含量達到90.48%，與粗品比較番茄堿的最終收率為81.84%。

2.5番茄堿抑菌活性的研究

2.5.1 番茄堿供試液的配制 稱取番茄堿晶體5.004 g，用甲醇溶解，定容于10 mL量瓶中，相當(dāng)于番茄堿的濃度為500.4 mg/mL，其陽性對照為1.5%的苯甲酸鈉溶液。

2.5.2 供試菌株的活化 在無菌室環(huán)境中將大腸埃希氏桿菌接入相對應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，置35～37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)18～24 h。培養(yǎng)好的試管斜面放置在0～4℃冰箱內(nèi)冷藏備用。

2.5.3 培養(yǎng)基平板的制備 將配制好的培養(yǎng)基在電爐上融化，置電熱恒溫水浴鍋中保持溫度至50～60℃。在無菌操作條件下將培養(yǎng)基傾注于高壓滅菌后的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿體積15～20 mL，放平置培養(yǎng)基凝固。

2.5.4 菌懸液的制備 取活化培養(yǎng)好的菌株，用接種環(huán)調(diào)取2環(huán)菌體，放入9 mL無菌生理鹽水中，搖勻，制成菌體懸浮液。

2.5.5 番茄堿與苯甲酸鈉的抑菌活性對照試驗 用打孔器將定性濾紙打成直徑為5 mm的小圓片，放入培養(yǎng)皿中置120℃恒溫箱中干熱滅菌2 h。將滅菌后的濾紙片分別浸泡于番茄堿供試液、1.5%苯甲酸鈉、無菌水中24 h。在無菌條件下，分別取0.2 mL菌懸液加入培養(yǎng)基平板中，用三角刮鏟涂布均勻。在接種后的平板上貼上浸泡好的濾紙片，培養(yǎng)皿背面分為3個部分，各貼供試液濾紙片、浸有1.5%苯甲酸鈉濾紙片及無菌水濾紙片(空白對照)。置35～37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)好后取出測抑菌圈直徑。結(jié)果番茄堿供試液、苯甲酸鈉溶液、空白對照樣的抑菌圈直徑分別為7.12、6.30、5.00 mm，452.8 mg/mL番茄堿的抑菌圈直徑比苯甲酸鈉的大(圖3)。

A: 番茄堿供試液

B: 苯甲酸鈉

C: 空白對照樣

圖3番茄堿和苯甲酸鈉對大腸埃希氏菌的抑菌效果圖

2.5.6 番茄堿最低抑菌濃度(MIC)的測定 配制番茄堿供試液，采用倍比稀釋法用甲醇將番茄堿稀釋成濃度分別為452.8、226.4、113.2、56.6、28.3、14.15 mg/mL的稀釋液，用無菌吸管分別吸取0.5 mL稀釋液加入到已制備好的培養(yǎng)基上。在其上按皿底的記號，用移液槍吸取0.1 mL菌懸液，涂于平板上，用三角刮鏟涂布均勻，置35～37 ℃溫度下培養(yǎng)18～24 h，觀察大腸埃希氏桿菌生長情況。另稀釋相同系列濃度番茄堿溶液，不接種菌作為對照，最低稀釋液濃度為完全沒有菌生長時對大腸埃希氏桿菌最低抑菌濃度(MIC)(n=6)。結(jié)果番茄堿的濃度降低到113.2 mg/mL時無大腸埃希氏菌生長，故可認為在本實驗中番茄堿的最低抑菌濃度為113.2 mg/mL(表1)。

表1 番茄堿對大腸埃希氏菌的MIC

注：“-”表示無菌生長，“+”表示有菌生長。

2.6不同條件對番茄堿抑菌活性的影響

2.6.1 pH對番茄堿抑菌活性的影響 用HCl和NaOH調(diào)節(jié)番茄堿供試液的pH值為3、4、5、6、7、8、9的不同溶液，將無菌濾紙片分別放入7種溶液中浸泡24 h，貼于涂有0.1 mL菌懸液的培養(yǎng)基上，置35～37 ℃溫度下培養(yǎng)18～24 h，測定各濾紙片的抑菌圈直徑，以比較不同的pH對番茄堿抑菌活性的影響(n=3)。結(jié)果不同的pH對番茄堿的抑菌活性有一定的影響。在pH為3～6時，番茄堿抑菌圈直徑為6～8 mm，且并無較大差別；在pH為7時番茄堿抑菌圈直徑擴大至最大，為7.82 mm，抑菌活性明顯增強，抑菌效果最好。堿性條件下番茄堿的抑菌活性強于在酸性條件下，原因是在堿性條件下，番茄堿析出，抑菌活性增強，且番茄堿在中性環(huán)境中抑菌性較強、熱穩(wěn)定性好(表2)。

表2 pH對番茄堿抑菌活性的影響

2.6.2 溫度對番茄堿抑菌活性的影響 分別取番茄堿供試液各5 mL，放入5個不同的小燒杯中，分別置于20、40、60、80、90℃水浴處理15 min后，將無菌濾紙片分別放入各個燒杯中浸泡24 h。貼于涂有0.1 mL菌懸液的培養(yǎng)基上，置35～37℃溫度下培養(yǎng)18～24 h，測定濾紙片的抑菌圈直徑，比較不同溫度對番茄堿抑菌活性的影響(n=3)。結(jié)果隨著溫度的升高，番茄堿的抑菌活性不斷增大，在60～80℃之間變化較大，原因是由于甲醇被蒸發(fā)，番茄堿的濃度增大，抑菌活性增強(表3)。

表3 溫度對番茄堿抑菌活性的影響

2.6.3 供試液與大腸埃希氏桿菌作用不同時間對抑菌活性的影響 取番茄堿供試液1 mL與0.1 mL的菌懸液混合，番茄堿取6個同樣的混合樣，搖勻，同時各放入1片濾紙片，經(jīng)過1、3、5、8、10、12 h，分別依次取出1～6號混合樣中的濾紙片，貼在涂有0.1 mL菌懸液的培養(yǎng)基上，置35～37 ℃溫度下培養(yǎng)18～24 h，測定濾紙片的抑菌圈直徑(n=3)。結(jié)果隨著番茄堿與菌懸液作用時間的延長，抑菌圈的直徑不斷增大，抑菌活性增強，由此可知：番茄堿與菌懸液作用時間越長，抑菌效果越好(表4)。

3 討論

具堿性的生物堿能和酸結(jié)合生成鹽，生物堿鹽一般易溶于水，難溶或不溶于親脂性有機溶劑，但可溶于甲醇或乙醇。生物堿鹽的水溶液加堿后生成的游離堿又可自水溶液中沉淀析出。番茄堿是仲胺類生物堿，具有親脂性，其氮原子上未共用電子對，容易與未全鹵代的鹵代烴中的氫形成了氫鍵，所以可將游離的番茄堿用氯仿萃取出來。番茄堿經(jīng)硅膠柱分離純化后，顯著提高了番茄堿的含量，并用HPLC-MS/MS對番茄堿進行定量分析。本實驗制得的番茄堿粗品為白色粉末，在分離純化粗品過程中，可以將大量的色素留在硅膠柱上，起到對番茄堿粗品脫色的作用?？咕幬飳τ诩毦囊种谱饔玫臋C理有抑制細菌細胞壁的合成、影響細胞膜通透性、抑制蛋白質(zhì)合成、抑制核酸代謝、影響葉酸代謝。

表4 不同作用時間對番茄苷抑菌活性的影響

本實驗初步研究發(fā)現(xiàn)一定濃度下的番茄堿對于大腸埃希氏桿菌具有抑制作用，其作用機理還有待于進一步的研究。

文獻參考：

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