潘鑫艷，王 麗，楊長紹，黎貴蕓，楊舉倫，蔡 琳

石蠟包埋脫鈣骨組織中結(jié)核桿菌DNA不同提取方法比較

潘鑫艷，王 麗，楊長紹，黎貴蕓，楊舉倫，蔡 琳

目的 探討石蠟包埋的10%硝酸脫鈣骨組織中簡易有效的結(jié)核桿菌DNA提取方法并進行驗證。方法 以20例石蠟包埋、10%硝酸脫鈣的壞死性肉芽腫炎疑為骨結(jié)核的組織標(biāo)本為研究對象，常規(guī)法直接采用德國QIAGEN公司的QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit方法提取DNA，而改良法中加入QIAamp?DNA Micro Kit試劑盒中的carrier RNA，以兩種方法分別提取20例標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA，通過熒光定量PCR，比較常規(guī)試劑盒提取法和改良提取法對結(jié)核桿菌檢測結(jié)果的影響。結(jié)果 改良法提取的DNA[(35.32±3.48)ng/μl]比常規(guī)法[(6.68±3.72)ng/μl]提取的DNA顯著增多(P<0.05)，改良法提取的DNA經(jīng)熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌的陽性率(55%)明顯高于常規(guī)法(15%，P<0.01)。結(jié)論 改良法提取石蠟包埋脫鈣骨組織中結(jié)核桿菌DNA具有高效簡便的特點，是較為理想的方法，值得在puncture和極微小石蠟樣本中推廣。

脫鈣骨組織；結(jié)核桿菌DNA；熒光定量PCR

目前，骨結(jié)核的診斷主要有影像學(xué)和血沉檢查。而近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光定量PCR成為檢測結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用最多的方法[1-2]。但是，石蠟包埋組織中結(jié)核桿菌DNA的檢測本身就仍然存在諸多問題[3]，石蠟包埋樣品PCR擴增成功率很低，原因之一是模板DNA的質(zhì)和量不夠[4]。有文獻報道了石蠟包埋的肺、淋巴結(jié)等其他骨外組織中結(jié)核桿菌DNA提取[5]及熒光定量PCR檢測[6]。對于石蠟包埋脫鈣的骨組織中結(jié)核桿菌DNA提取及檢測報道較少，同時由于骨組織經(jīng)過硝酸等脫鈣處理后，DNA受到嚴重破壞降解，造成提取的DNA質(zhì)量比一般石蠟包埋組織中的更差，從而嚴重影響骨組織中結(jié)核分枝桿菌的檢測。因此，本研究從實際應(yīng)用從發(fā)，尋找石蠟包埋脫鈣骨組織中檢測結(jié)核桿菌DNA的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 收集我科2012～2013年的骨組織標(biāo)本20例，所有骨組織標(biāo)本均經(jīng)10%硝酸脫鈣24 h以上，經(jīng)病理醫(yī)師診斷為壞死性肉芽腫炎，考慮結(jié)核。每例標(biāo)本切片8 μm×20片，每10片放入一個1.5 ml的無菌離心管中，分成2組，每組20例。

1.1.2 主要試劑 QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit(Cat.NO.56404)、QIAamp?DNA Micro Kit(Cat.NO.56304)、結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測試劑盒，均購于德國QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本預(yù)處理 兩組樣本每管加入1.2 ml二甲苯脫蠟3次；無水乙醇重復(fù)3次，去除二甲苯；55 ℃恒溫器干燥組織。每管加入180 μl試劑盒(QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit)中ATL和20 μl蛋白酶K，56 ℃水浴過夜(12 h以上)消化。

1.2.2 DNA提取 (1)常規(guī)QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取法:消化過夜的樣品置于90 ℃水浴1 h以滅活蛋白酶K，短暫離心后迅速加入200 μl BufferAL和200 μl無水乙醇，充分混勻，短暫離心。后續(xù)步驟按照QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit 說明書進行。(2)改良QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒提取法:消化過夜的樣品置于90 ℃水浴1 h以滅活蛋白酶K，短暫離心后按照200∶1的比例每管迅速加入AL和QIAamp?DNA Micro Kit試劑盒中特有的carrier RNA，上下顛倒混勻，加入200 μl無水酒精，繼續(xù)按照1.2.1中QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit試劑盒說明書中的后續(xù)步驟提取基因組DNA。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測 上述提取的石蠟包埋脫鈣骨組織中基因組DNA，分別取2 μl，用紫外分光光度計測量兩組樣品DNA的濃度、純度。

1.2.4 熒光定量PCR檢測 (1)PCR擴增:PCR擴增體系為40 μl，配制按照結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測試劑盒說明書操作步驟進行，體系放入熒光定量PCR儀(Bio-rad CFX96)中檢測和數(shù)據(jù)分析。每批檢測標(biāo)本均設(shè)置陽性、陰性對照。PCR反應(yīng)參數(shù)：37 ℃，5 min；94 ℃，1 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；循環(huán)40次，使用熒光定量PCR儀檢測，熒光信號收集時設(shè)定為FAM熒光素，熒光信號收集設(shè)置在60 ℃。(2)判讀標(biāo)準(zhǔn):檢測樣本Ct值=40和無數(shù)值時，判斷為陰性；檢測樣本Ct值<37.0時，判斷為陽性；若37.0≤檢測樣本Ct值≤40時，應(yīng)重復(fù)檢測，復(fù)查結(jié)果Ct值<40均可判斷為陽性，否則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 DNA濃度及純度鑒定 改良法提取的DNA比常規(guī)法提取的DNA顯著增多(P<0.01，表1)，兩者純度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，表1)。

表1 兩種方法提取的DNA濃度和純度比較

注：與常規(guī)法比較，①P<0.01

2.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果 常規(guī)法組20例脫鈣骨組織中，3例結(jié)核分枝桿菌陽性，陽性率為15%；而改良法組中檢測出11例結(jié)核桿菌陽性，陽性率為55%。改良法組結(jié)核分枝桿菌檢出率明顯高于常規(guī)組(P<0.01)。同時，常規(guī)法組熒光定量PCR檢測Ct值均在38左右，處于判讀臨界值，而改良法組Ct值為34左右，Ct值明顯小于常規(guī)法組，擴增曲線也明顯高于常規(guī)法組，提示改良法提取脫鈣骨組織中結(jié)核桿菌DNA的擴增效率優(yōu)于常規(guī)組(圖1)。

3 討論

1989年，Hance等[7]將PCR技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌的檢測，近年來，越來越多的文獻[6,8,9]報道了用熒光定量PCR方法檢測石蠟包埋組織中的結(jié)核分枝桿菌。而大部分都是針對石蠟包埋的肺、淋巴結(jié)、胸腹膜等骨外組織。但是，結(jié)核桿菌可侵犯全身各器官，當(dāng)累及骨組織時就會發(fā)生骨結(jié)核病。

骨組織不同于一般的軟組織，是一種堅硬的結(jié)締組織，由黏多糖和一些膠原纖維樣骨膠纖維構(gòu)成的骨樣組織和沉著于其中的無機鹽(骨鹽)形成的。無機鹽以羥基磷灰石結(jié)晶的形式存在，其中絕大部分為水合磷酸鈣，此外還包括微量碳酸鹽和檸檬酸鹽等[10-11]。因此，骨組織及鈣化病灶經(jīng)福爾馬林固定后，必須先將鈣鹽除去使組織軟化，才能進行后續(xù)制片及其他分子檢測，常規(guī)脫鈣液是10%的硝酸。硝酸是臨床病理活檢中最實用的一種常規(guī)脫鈣劑，脫鈣迅速、完全可靠、作用強、時間短、效果好，但是對骨組織的破壞作用較大[12]，導(dǎo)致DNA的降解。本研究針對脫鈣的骨組織，選取適合的DNA提取方法，用熒光定量PCR方法檢測結(jié)核桿菌。

圖1 不同方法提取石蠟包埋脫鈣骨組織中DNA經(jīng)熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌結(jié)果

左：常規(guī)法提取石蠟包埋脫鈣骨組織中DNA，經(jīng)熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌的擴增曲線；右：改良法提取石蠟包埋脫鈣骨組織中DNA，經(jīng)熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌的擴增曲線

經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋過的組織中，DNA堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)[13]，這種福爾馬林介導(dǎo)的甲基化直接影響DNA提取的效率。Warford等[13]也發(fā)現(xiàn)，單細胞懸液經(jīng)30 min福爾馬林固定后，DNA產(chǎn)量減少到30%。因此，福爾馬林固定會導(dǎo)致DNA的降解。酸性環(huán)境中DNA的降解已有過深入的研究。一般認為，強酸可導(dǎo)致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些結(jié)構(gòu)的改變。而骨組織需經(jīng)福爾馬林固定、10%硝酸脫鈣12 h以上，因此DNA降解得更多，含量更少。用一般的DNA提取方法得到的DNA質(zhì)和量無法滿足后續(xù)實驗，從石蠟包埋組織中檢測結(jié)核桿菌的最小DNA量為20 ng/μl(熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌試劑盒要求)。

QIAGEN公司的FFPE試劑盒是專門針對石蠟包埋組織，它能打破堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)，經(jīng)蛋白酶K消化，過柱純化得到DNA(常規(guī)法)。但FFPE試劑盒提取穿刺和微小組織或脫鈣組織中的DNA效果不佳。本實驗采用常規(guī)FFPE試劑盒提取的脫鈣骨組織DNA濃度非常低，為(6.68±3.72)ng/μl，基本無法到達結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(QIAGEN公司)要求檢測的最低DNA濃度(20 ng/μl)。而我們在常規(guī)FFPE試劑盒中加入QIAGEN公司微量提取物DNA試劑盒中的carrier RNA(改良法)，結(jié)果很大程度地提高了DNA產(chǎn)量，達到(35.32±3.48)ng/μl，二者有統(tǒng)計學(xué)差異，而DNA純度無顯著差異。

兩法提取的脫鈣骨組織DNA經(jīng)熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌發(fā)現(xiàn)，常規(guī)法組檢測結(jié)核桿菌的陽性率明顯低于改良法組。石蠟組織樣品PCR擴增成功率低原因之一，就是模板DNA的質(zhì)和量不夠，特別對于硝酸脫鈣后的骨組織，DNA遭到嚴重破壞降解，用常規(guī)方法提取出來的質(zhì)量不達標(biāo)，會對后續(xù)檢測造成假陰性結(jié)果。改良法引入的而是一種RNA載體，特別是樣品中DNA含量極少的情況下，它能增強DNA與QIAamp 離心柱中膜的結(jié)合，更大程度上獲得全部DNA。但由于額外添加了carrier RNA，因此，最終得到的產(chǎn)物中可能含有添加的carrier RNA，必須按照試劑盒說明按AL緩沖液與carrier RNA比例為200∶1加入。這樣即使含有額外加入的carrier RNA，因為RNA容易降解，可以采取晾干時間延長的方法降解而去除掉carrier RNA，得到純度較高的樣品DNA。

結(jié)核分枝桿菌起始拷貝數(shù)的對數(shù)值與每個模板的Ct值呈良好的線性關(guān)系[14]，也就是說，起始模板DNA濃度越大，熒光定量PCR擴增的Ct值越小，有效防止脫鈣骨組織中結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測結(jié)果為臨界值(37≤Ct≤40)，提高檢測的敏感性，增加結(jié)果的可判讀性。本實驗結(jié)果表明：改良法提取的石蠟包埋脫鈣骨組織DNA質(zhì)量顯著提高了5倍，熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌的陽性率從15%提高到了55%，大大增加了陽性率，提高了敏感性，避免了由于DNA質(zhì)量過少造成的假陰性結(jié)果，對病理診斷提供了輔助作用。

該DNA提取方法的改良和DNA質(zhì)量的提高，可用于微量石蠟包埋組織的幾乎所有基因分析技術(shù)，解決了以往由于提取的DNA質(zhì)量不夠而無法進行后續(xù)基因分析的問題。改良法適用于穿刺標(biāo)本和微量石蠟包埋組織DNA提取，比如穿刺小細胞肺癌標(biāo)本進行EGFR檢測，為臨床靶向治療提供依據(jù)，可避免再次取材給患者帶來的痛苦。同時改良法與常規(guī)試劑盒提取法相比，沒有增加多余的實驗步驟，操作簡單，也不浪費實驗時間。因此，該方法是一種值得完善和推廣的DNA提取方法。

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Comparison of different extraction methods ofMycobacteriumtuberculosisDNA in paraffin-embedded decalcified bone tissues

Pan Xinyan,Wang Li,Yang Changshao,Li Guiyun,Yang Julun,Cai Lin

Departent of Pathology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To explore and verify the extraction method ofmycobacteriumtuberculosisDNA in paraffin-embedded and 10% nitric acid decalcified bone tissues.Methods Twenty paraffin-embedded and 10% nitric acid decalcified specimens of necrotic granuloma suspected as bone tuberculosis were chosen as subjects.QIAamp?DNA FFPE Tissue kit was used in the conventional method to extract DNA.While in the modified method,carrier RNA was added into the QIAamp?DNA Micro kit.ThemycobacteriumtuberculosisDNAs of the 20 specimens were extracted by the two methods,respectively.Fluorescence quantitative PCR was used to compare the effects of the two methods on the detection results ofmycobacteriumtuberculosis.Results The amount of DNA extracted by the modified method[(35.32±3.48)ng/μl]was significantly more than that extracted by the conventional method[(6.68±3.72)ng/μl,P<0.05].The positive rate ofmycobacteriumtuberculosisfor DNA detected by the modified method(55%)was significantly higher than that detected by the conventional method(15%,P<0.05).Conclusion The modified extraction ofmycobacteriumtuberculosisDNA from paraffin-embedded decalcified bone tissues is more efficient and simple,which is an ideal method and worthwhile to be promoted in the puncture and little paraffin-embedded tissues.

decalcified bone tissue;mycobacteriumtuberculosisDNA;fluorescence quantitative PCR

650032 昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科

蔡 琳，電話：13888596523

R 378.911

A

1004-0188(2014)02-0160-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.016

2013-11-06)