朱劍武,李夢俠,王 東,高 天

IGSF4基因在非小細(xì)胞肺癌中甲基化狀態(tài)及其意義研究

朱劍武,李夢俠,王 東,高 天

目的 通過MassARRAY 質(zhì)譜甲基化測序檢測,分析IGSF4基因的啟動(dòng)子區(qū)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的甲基化修飾規(guī)律和特點(diǎn),進(jìn)一步探討NSCLC早期診斷新方法。方法 首先利用MassARRAY 質(zhì)譜甲基化測序及甲基化特異PCR(MSP)觀察該基因在NSCLC中的甲基化狀態(tài),再通過RT-PCR驗(yàn)證其在NSCLC中表達(dá)情況。結(jié)果 MassARRAY 質(zhì)譜甲基化測序方法對7例NSCLC和3例正常對照血樣檢測結(jié)果顯示,IGSF4基因啟動(dòng)子區(qū)8個(gè)CpG位點(diǎn)在NSCLC中甲基化程度明顯增高(P<0.01),呈高度甲基化狀態(tài)；MSP結(jié)果亦顯示,IGSF4基因在NSCLC中與正常外周血比較呈高甲基化；在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證IGSF4基因表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在NSCLC中呈低表達(dá)。結(jié)論 IGSF4基因在NSCLC中呈高甲基化狀態(tài),在NSCLC中低表達(dá),可作為無創(chuàng)性早期診斷NSCLC的新方法。

非小細(xì)胞肺癌；DNA 甲基化；IGSF4；A549細(xì)胞株；MSP

肺癌在本質(zhì)上是一個(gè)基因疾病,肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)癌基因激活、抑癌基因失活的多基因參與的多步驟、多階段,由體內(nèi)外因素相互作用的復(fù)雜過程。大量研究發(fā)現(xiàn),各種癌癥都可以發(fā)現(xiàn)存在有抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化,從而帶來轉(zhuǎn)錄抑制,肺癌也如此[1]。目前,對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的分型診斷只能通過常規(guī)的病理診斷、影像學(xué)分析及相關(guān)輔助檢查進(jìn)行鑒別分析,尚沒有一個(gè)明確的可以真正指導(dǎo)臨床對NSCLC進(jìn)行病理分型的特異標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道[2],44%的NSCLC的IGSF4 基因的啟動(dòng)子發(fā)生甲基化。本課題組在既往的研究中發(fā)現(xiàn),IGSF4基因啟動(dòng)子在NSCLC中mRNA水平有明顯變化,即在NSCLC中該基因的表達(dá)量明顯低于正常組織。本研究擬通過MassARRAY質(zhì)譜甲基化檢測平臺(tái),分析IGSF4 基因的啟動(dòng)子區(qū)在NSCLC中的甲基化修飾規(guī)律和特點(diǎn),以期指導(dǎo)臨床NSCLC病理分型的早期診斷,為臨床肺癌分型開拓新途徑。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇本院2012年6～12月采集的已明確診斷的NSCLC患者血液標(biāo)本共8例(包括第一階段MassARRAY 質(zhì)譜甲基化測序檢測實(shí)驗(yàn)所用7例和MSP驗(yàn)證新增的1例),患者無任何基礎(chǔ)疾病及免疫抑制劑治療史。對照正常血液標(biāo)本取自健康體檢成人外周靜脈血共6例(包括第一階段實(shí)驗(yàn)用3例和第二階段MSP新增3例)。并同時(shí)收集檢測對象的臨床資料,包括患者的年齡、性別、民族、籍貫、聯(lián)系電話等一般信息,臨床常規(guī)檢測指標(biāo)及病理診斷。本研究得到本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),取材均征得檢測對象知情同意。

1.2 樣本基因組DNA及RNA的提取 基因組DNA提取試劑盒購自MN公司,提取過程按試劑盒說明操作；基因組DNA的亞硫酸鹽處理所用的試劑盒CpGenome DNA modification Kit購自Qiagen公司,處理過程按試劑盒說明操作?？俁NA提取采用Trizol(北京百泰克生物公司)提取外周靜脈血中總RNA,通過異丙醇沉淀法濃縮RNA,進(jìn)一步采用NucleoSpin RNA clean-up試劑盒(MACHEREY-NAGEL,Germany)對總RNA進(jìn)行過柱純化,用Nonadrop測定濃度和純度,并電泳檢測其完整性。

1.3 MassARRAY Epityper DNA甲基化定量檢測 通過MassARRAY Epityper DNA甲基化定量技術(shù),檢測各標(biāo)本中IGSF4基因啟動(dòng)子甲基化程度。MassARRAY Epityper DNA平臺(tái)是結(jié)合堿基特異性酶切(分子切割)和MALDI-TOF檢測原理,實(shí)現(xiàn)多重CpG的分析檢測,該檢測分析由亞硫酸鹽處理待測DNA開始,經(jīng)過亞硫酸鹽處理,DNA中未甲基化胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U),而甲基化修飾的胞嘧啶不受影響,因此,亞硫酸鹽處理將產(chǎn)生甲基化特異的序列變化。然后利用5'末端帶有T7-啟動(dòng)子的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)堿基特異性的酶切反應(yīng)后,DNA 片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化,飛行質(zhì)譜(北京博奧生物芯片有限公司)能測出每個(gè)片段的分子量,配套軟件EpiTYPER自動(dòng)報(bào)告每個(gè)相應(yīng)片段的甲基化程度[3]。

1.4 甲基化敏感性PCR(MSP) dNTPs購自TaKaRa公司,DNA純化試劑盒購自MN公司,Hot star enzyme Kit購自Qiagen公司,甲基化特異性PCR引物均由Invitrogen公司合成。具體步驟參照試劑盒說明。

1.5 熒光定量PCR 選取正常人肺細(xì)胞株MRC和肺癌細(xì)胞株A549(由本課題組傳代獲得),觀察IGSF4在其表達(dá)情況。采用晶芯?SuperGreen熒光定量PCR通用試劑盒,實(shí)驗(yàn)方法按說明進(jìn)行。引物采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)。總RNA的提取方法同“1.2”,用Nonadrop測定濃度和純度,并電泳檢測其完整性。RNA分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量時(shí),D(260)/D(280)在1.8～2.0,甲醛變性凝膠電泳28 S和18 S rRNA比值在2.0左右。鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好,生長密度超過80%,可以用于RNA提?。籖NA逆轉(zhuǎn)錄后待擴(kuò)增。看家基因采用β-actin基因。引物設(shè)計(jì)如表1。

表1 IGSF4、β-actin基因?qū)崟r(shí)PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 聚類分析結(jié)果 采用分層聚類分析方法,對7例NSCLC和3例正常對照血樣MassARRAY Epityper DNA甲基化定量檢測結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,成功將NSCLC與正常外周血區(qū)分成兩部分,IGSF4基因啟動(dòng)子區(qū)在NSCLC中呈高度甲基化(圖1)。

圖1 MassARRAY Epityper DNA甲基化定量檢測結(jié)果IGSF4基因分層聚類分析結(jié)果

深色部分代表甲基化程度高,淺色區(qū)域代表甲基化程度低

2.2 IGSF4基因CpG位點(diǎn)的分析結(jié)果 將8個(gè)被檢測到的CpG位點(diǎn)的甲基化程度逐一進(jìn)行t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果顯示,8個(gè)位點(diǎn)在NSCLC樣品與對照組中均有顯著性差異(P<0.01,表2),進(jìn)一步證實(shí)與芯片聚類分析結(jié)果一致。

表2 IGSF4基因8個(gè)被檢測到的CpG位點(diǎn)t檢驗(yàn)結(jié)果

注：樣品1～7為NSCLC；8～10為正常外周血

2.3 甲基化特異PCR(MSP)驗(yàn)證結(jié)果 MSP結(jié)果顯示,IGSF4基因在NSCLC中與正常外周血比較也呈高甲基化狀態(tài)(圖2)。

2.4 IGSF4基因在NSCLC細(xì)胞株中表達(dá)情況 β-ACTIN實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,與正常人MRC-5細(xì)胞株比,該基因在肺癌細(xì)胞株A549中呈低表達(dá)(圖3)。

圖2 MSP檢測結(jié)果

M：Marker,DL2000；1～8：NSCLC；9～14：正常外周。此部分實(shí)驗(yàn)樣品在結(jié)果1中所用標(biāo)本基礎(chǔ)上新增1例NSCLC樣品及3例正常外周血標(biāo)本

圖3 IGSF4基因與β-ACTIN實(shí)時(shí)定量PCR鑒定

M：Marker,DL2000；1：IGSF4基因-A549細(xì)胞株；2：IGSF4基因-MRC-5細(xì)胞株；3：β-ACTIN-A549細(xì)胞株；4：β-ACTIN-MRC-5細(xì)胞株

3 討論

從蛋白水平檢測分析,目前相對比較認(rèn)同的肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物有CEA、NSE、CA125、CYFRA21-1、VEGF等[4],但尚沒有一個(gè)明確的可以真正指導(dǎo)臨床對NSCLC進(jìn)行病理分型的特異標(biāo)志物。

隨著DNA 甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展和完善,通過尋找受甲基化調(diào)控的新位點(diǎn)來診斷和治療疾病,已經(jīng)逐漸成為相關(guān)腫瘤的分子診斷和治療的手段之一[5]。DNA甲基化狀態(tài)的改變是肺癌發(fā)生的重要因素,這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高,從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達(dá)[6]。IGSF4是免疫球蛋白超家族新成員,IGSF4 編碼的一段1.6或4.4 kb RNA序列位于11q23.2,最終翻譯成一個(gè)442個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。已經(jīng)證實(shí)IGSF4甲基化失活與肺癌、胰腺癌的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)[7-9],而國內(nèi)外尚未見有IGSF4基因的啟動(dòng)子區(qū)在NSCLC中的甲基化情況以及分子機(jī)制的研究報(bào)道。

本課題前期通過體外實(shí)驗(yàn)觀察IGSF4在兩種細(xì)胞株中甲基化狀態(tài),分別用人正常肺細(xì)胞株MRC-5和肺癌A549細(xì)胞株,通過MSP方法驗(yàn)證了IGSF4基因確實(shí)是甲基化程度高的基因位點(diǎn)。由于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生,因此,基因組的甲基化檢測對于腫瘤的提前診斷和監(jiān)測腫瘤的發(fā)展具有重大的意義。本研究經(jīng)MassARRAY質(zhì)譜甲基化測序方法[10-11],對7例NSCLC和3例正常對照血樣對比分析,結(jié)果顯示,被檢測的IGSF4啟動(dòng)子區(qū)8個(gè)CpG位點(diǎn)在NSCLC中甲基化程度明顯增高(P<0.01),呈高度甲基化狀態(tài)；在表達(dá)水平上對IGSF4基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與正常人MRC-5細(xì)胞株比,該基因在A549細(xì)胞株中呈低表達(dá)。

綜上分析推測,IGSF4基因啟動(dòng)子在NSCLC中較正常組織甲基化程度高,并且這種差異可能指導(dǎo)臨床對NSCLC的早期診斷。因此,本研究將進(jìn)一步探討IGSF4基因與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為臨床提供新的NSCLC病理分型的分子標(biāo)記靶點(diǎn)。

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Study on methylation status of gene IGSF4 in NSCLC and significance

Zhu Jianwu1,Li Mengxia1,Wang Dong1,Gao Tian2

1.Cancer Center,Research Institute of Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400042,China;2.Department of Gynecology and Obstetrics,the First Affiliated Hospital to Chongqing Medical University,Chongqing,400041,China

Objective To analyze the regulation and characteristics of methylation of the promoter region of the gene IGSF4 in NSCLC with MassARRAY Epityper for a further study of new early diagnostic method of NSCLC.Methods MassARRAY Epityper and methylation-specific PCR(MSP)were applied to observe the methylation status of the gene in NSCLC and the expression of the gene in NSCLC were verified by real-time PCR.Results The detection results of blood samples from 7 cases with NSCLC and 3 normal controllers by MassARRAY Epityper revealed a hypermethylation of 8 CpG sites in the promoter region of IGSF4(P<0.01);the results of MSP also showed a hypermethylation of IGSF4 in NSCLC;the result of real-time PCR showed a lower level of IGSF4 in NSCLC patients than the normal control in the cellular level.Conclusions IGSF4 is in hypermethylation status and low expression in cellular level in NSCLC,which may serve as a new method of noninvasive early diagnosis of NSCLC.

NSCLC;DNA methylation;IGSF4;A549;MSP

重慶市自然科學(xué)基金(CSTC2010BB5198)

400042 重慶,第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心(朱劍武,李夢俠,王 東)；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(高 天)

高 天,電話：0801-757207；E-mail：cecilia7@sohu.com

R 734.2

A

1004-0188(2014)09-0932-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.09.002

2014-07-22)