趙純成,周 鋼,李遠(yuǎn)洪,張 林

T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)與結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)對(duì)腸結(jié)核的診斷價(jià)值

趙純成,周 鋼,李遠(yuǎn)洪,張 林

目的 探討結(jié)核桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(T-spot-TB)與結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)在腸結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 對(duì)2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB與結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)的可疑腸結(jié)核患者128例進(jìn)行回顧性分析,其中確診腸結(jié)核72例,非腸結(jié)核56例。對(duì)比分析兩種方法診斷腸結(jié)核的靈敏度及特異度。結(jié)果 T-spot-TB診斷腸結(jié)核靈敏度為90.3%,特異性為91.1%；結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)靈敏度為73.6%,特異性為100.0%。T-spot-TB診斷腸結(jié)核靈敏度高于DNA檢測(cè),但其特異性低于DNA檢測(cè)；兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率在不同病理表現(xiàn)的腸結(jié)核患者中無顯著差異。兩種方法同時(shí)檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值均為100%。結(jié)論 T-spot-TB與結(jié)核桿菌DNA聯(lián)合檢測(cè)有助于提高腸結(jié)核診斷的靈敏度和特異度。

腸結(jié)核；結(jié)核桿菌；T細(xì)胞；斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)；DNA檢測(cè)；診斷

隨著結(jié)核感染在全球范圍內(nèi)的死灰復(fù)燃,目前結(jié)核的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)。腸結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌侵犯腸黏膜引起的腸道特異性感染,部分腸結(jié)核與克羅恩病、潰瘍型結(jié)腸炎及其他非特異性腸道炎癥有相似的臨床特征,缺乏特異性表現(xiàn),鑒別診斷非常困難[1-2]。結(jié)核T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-spot-TB)通過檢測(cè)結(jié)核感染后T細(xì)胞分泌的特異性γ-干擾素來診斷是否存在結(jié)核感染,對(duì)結(jié)核診斷的特異性和敏感性較高[3-4],有助于腸結(jié)核的診斷和鑒別診斷[5]。結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)提高了結(jié)核診斷的特異性[6],有助于腸結(jié)核與克羅恩病的鑒別[7-8]。有關(guān)兩種方法應(yīng)用于腸結(jié)核的診斷和鑒別診斷的對(duì)比分析,目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道少見。本研究對(duì)比分析了T-spot-TB與結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)在診斷腸結(jié)核中的價(jià)值,為腸結(jié)核的診斷及鑒別診斷方法的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例資料 對(duì)2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB與結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)的可疑腸結(jié)核患者128例進(jìn)行回顧性分析。其中男性86例,女性42例,年齡16～72(36.3±24.2)歲；最終確診腸結(jié)核72例,非腸結(jié)核56例(包括克羅恩病32例,腸淋巴瘤10例,結(jié)腸癌6例,潰瘍性結(jié)腸炎4例,腸息肉或腺瘤4例)。腸結(jié)核的最終診斷依據(jù)臨床表現(xiàn)、腸鏡下表現(xiàn)、病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)干酪樣肉芽腫、抗酸染色陽(yáng)性、抗結(jié)核實(shí)驗(yàn)性治療有效等；克羅恩病及潰瘍性結(jié)腸炎診斷符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的炎癥性腸病診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；腸淋巴瘤、腸息肉或腺瘤均由病理學(xué)檢查確診。

1.2 T-spot-TB檢測(cè) 采用英國(guó)Oxford Immunoter公司提供的試劑盒進(jìn)行檢測(cè),標(biāo)本為抗凝外周靜脈血4 ml。首先采用密度梯度離心法分離、收集外周血單個(gè)核細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液。T-spot檢測(cè)按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔、A和B檢測(cè)孔,各孔均包被IFN-γ抗體,分別加入陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、結(jié)核桿菌特異性抗原A和B。按照試劑盒說明書,每孔加入(2.0～3.0)×105個(gè)單個(gè)核細(xì)胞,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16～20 h。然后經(jīng)洗脫后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IFN-γ抗體,4 ℃孵育2 h,PBS洗脫,顯色,顯微鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：若陰性對(duì)照組斑點(diǎn)數(shù)<6個(gè),測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)多于陰性孔6個(gè)以上為陽(yáng)性；若陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè),測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)為陰性對(duì)照孔2倍或2倍以上為陽(yáng)性。

1.3 結(jié)核桿菌DNA檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)患者腸黏膜組織中結(jié)核桿菌DNA的表達(dá)。PCR試劑盒購(gòu)自科華公司,儀器采用 Roche公司生產(chǎn)的LightCycler熒光定量分析儀。腸鏡下活檢鉗取可疑病變組織1塊,立即置于Eppendorf管中,加入DNA提取液50 μl,混勻后,100 ℃沸水浴10 min,10 000 r/min離心5 min,提取上清液進(jìn)行DNA擴(kuò)增。按照試劑盒操作說明書進(jìn)行,設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照,按照文獻(xiàn)[8]引物序列、反應(yīng)條件及循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度123 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,如出現(xiàn)目標(biāo)條帶則為陽(yáng)性。

表1 128例患者T-spot-TB及結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)情況[n(%)]

注：與對(duì)照組相比,①P<0.05

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,2×2列表計(jì)算檢測(cè)方法的靈敏度、特異度,統(tǒng)計(jì)檢測(cè)指標(biāo)陽(yáng)性率,進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)靈敏度和特異度 T-spot-TB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)72例腸結(jié)核患者中,陽(yáng)性65例,陰性7例,檢測(cè)腸結(jié)核靈敏度為90.3%,假陰性率為9.7%；56例非腸結(jié)核患者中,陽(yáng)性5例,陰性51例,診斷腸結(jié)核特異性為91.1%,假陽(yáng)性率為8.9%。結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)72例腸結(jié)核患者中,陽(yáng)性53例,陰性19例,靈敏度為73.6%,假陰性率為26.4%；非腸結(jié)核患者中,陽(yáng)性0例,陰性56例,特異性為100.0%,假陽(yáng)性率為0.0%。T-spot-TB診斷腸結(jié)核靈敏度高于DNA檢測(cè),但其特異性低于DNA檢測(cè)。見表1。

2.2 兩種檢測(cè)方法對(duì)腸結(jié)核不同病理表現(xiàn)的檢測(cè)結(jié)果 72例腸結(jié)核患者中,肉芽腫(-)者28例,其中T-spot-TB陽(yáng)性率為85.7%,DNA陽(yáng)性率為71.4%。肉芽腫患者44例,其中發(fā)現(xiàn)干酪樣壞死11例,其余33例未見干酪樣壞死。11例干酪樣壞死患者中,T-spot-TB陽(yáng)性率為100.0%,DNA陽(yáng)性率為81.8%；33例干酪樣壞死陰性患者中,T-spot-TB陽(yáng)性率為90.9%,DNA陽(yáng)性率為72.7%。兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率在不同病理表現(xiàn)的腸結(jié)核患者中無顯著差異。見表2。

表2 不同病理表現(xiàn)腸結(jié)核患者T-spot-TB及結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.3 兩種方法聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果 兩種方法均陽(yáng)性患者50例,最終均證實(shí)均為腸結(jié)核,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%；兩種方法均陰性患者42例,均證實(shí)為非腸結(jié)核,陰性預(yù)測(cè)值為100%。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)腸結(jié)核的敏感度為69.4%,特異性為100%。見表3。

表3 兩種方法聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果(腸結(jié)核陽(yáng)性例數(shù))

3 討論

傳統(tǒng)的結(jié)核診斷方法包括結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)、抗酸染色、結(jié)核桿菌培養(yǎng)等,存在靈敏度差、耗時(shí)長(zhǎng)、特異性差等不足,尚不足以滿足臨床診斷的需要。近年來,T-spot-TB及結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用增加了腸結(jié)核診斷的靈敏度和特異度,史笑梅等[10]報(bào)道,T-spot-TB診斷腸結(jié)核的靈敏度為92.0%,特異度為92.3%。邱志兵等[11]報(bào)道,T-spot-TB檢測(cè)腸結(jié)核靈敏度為92.3%,特異度為77.5%。而結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)診斷活動(dòng)性腸結(jié)核靈敏度為53.85%,特異度為85%。雷少妮等[5]報(bào)道,T-spot-TB檢測(cè)腸結(jié)核的靈敏度和特異度分別為85.7%與93.3%。本組資料顯示,T-spot-TB檢測(cè)腸結(jié)核的靈敏度為90.3%,特異度為91.1%,與上述報(bào)道基本相符。

隨著PCR技術(shù)的不斷進(jìn)展,結(jié)核桿菌DNA的檢測(cè)目前已廣泛應(yīng)用于臨床結(jié)核的診斷。通過特異性體外擴(kuò)增結(jié)核桿菌DNA片段達(dá)到診斷的目的,提高了診斷的靈敏度,較結(jié)核桿菌培養(yǎng)耗時(shí)明顯縮短。陳瑜君等[12]檢測(cè)結(jié)腸石蠟包埋標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA診斷腸結(jié)核靈明度為32.0%,特異度為100.0%。顧清等[7]通過檢測(cè)石蠟包埋及新鮮腸黏膜標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靈敏度為63.89%,特異度為83.33%。本組資料均為新鮮腸黏膜標(biāo)本,結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)靈敏度為73.6%,特異度為100%。本組靈敏度高于上述報(bào)道,可能是所取標(biāo)本為新鮮腸黏膜組織,減少了DNA的降解,保證了檢測(cè)的靈敏度。

本研究還發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測(cè)在是否存在肉芽腫或是否檢出干酪樣壞死的患者中,陽(yáng)性率并無顯著差異,可見這兩種檢測(cè)方法不受腸結(jié)核病理類型的影響。兩者相比,T-spot-TB的靈敏度高于DNA檢測(cè),但其特異度低于DNA檢測(cè)。而兩者同時(shí)陽(yáng)性的特異性為100%,陰性預(yù)測(cè)率為100%。

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Value of T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis in diagnosing intestinal tuberculosis

Zhao Chuncheng,Zhou Gang,Li Yuanhong,Zhang Lin

Department of Gastroenterology,Central Hospital of Jiangjin District,Chongqing,402260,China

Objective To explore the value of T cell spot test(T-spot-TB)and detection of tuberculosis DNA in the diagnosis of intestinal tuberculosis.Methods A retrospective analysis was made to the clinical data of 128 suspected cases with intestinal tuberculosis undergoing T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis in the period from June,2009 to April,2013,including 72 cases with intestinal tuberculosis of confirmed diagnosis and 56 cases with no intestinal tuberculosis;a contrast analysis was made to the sensitivity and specificity of the 2 methods in diagnosing intestinal tuberculosis.Results The sensitivity of T-cell spot test in diagnosing tuberculosis was 90.3% and the specificity was 91.1%,while the sensitivity of DNA detection of tuberculosis was 73.6% and the specificity was 100%;the sensitivity of T-cell spot test in diagnosing intestinal tuberculosis was higher than that of DNA detection,but its specificity was lower than that of DNA detection;the positive rates of the 2 methods were of no obvious difference in cases with intestinal tuberculosis of different pathological manifestation;the positive and negative predictive values of the 2 methods when performed simultaneously were 100%.Conclusions To perform T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis at the same time can promote the sensitivity and specificity in diagnosing intestinal tuberculosis.

intestinal tuberculosis;mycobacteriumtuberculosis;T-cell;spot test;DNA detection;diagnosis

402260 重慶,重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科

R 526

A

1004-0188(2014)09-0955-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.09.011

2014-06-19)