趙 軍,趙美琴,史長征,陳紅輝

基于SIRT1軸探討不同強(qiáng)度有氧運動對NAFLD大鼠脂肪性肝炎的影響

趙 軍1,2,趙美琴3,史長征4,陳紅輝2

目的：研究不同強(qiáng)度的有氧運動對NAFLD大鼠肝臟炎性病變的影響。方法：雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為普通安靜組(ND)、高脂安靜組(C)、高脂小強(qiáng)度運動組(LE)、高脂中等強(qiáng)度運動組(ME)、高脂較大強(qiáng)度運動組(IE)。普通組和高脂組分別以普通或高脂飼料喂養(yǎng)，共計16周，運動組進(jìn)行6周跑臺運動。實驗結(jié)束時，進(jìn)行肝HE染色組織學(xué)分析，PI/PO MRI對肝脂質(zhì)進(jìn)行半定量分析，腹主動脈血測定血清肝功能酶和血脂含量，肝組織勻漿測定SOD、MDA水平，熒光定量PCR和Western Blot，分別測定SIRT1、MCP1、NCF2、PPARα mRNA表達(dá)以及SIRT1、核NF-κBp65蛋白表達(dá)。結(jié)果：高脂喂養(yǎng)16周后，高脂安靜組大鼠發(fā)生脂肪肝炎和纖維化變，6周有氧運動可減少運動組大鼠肝脂質(zhì)沉積，改善肝組織氧化應(yīng)激；與小強(qiáng)度運動相比，中等及較高強(qiáng)度運動促進(jìn)HMW脂聯(lián)素分泌、增加肝細(xì)胞SIRT1基因和蛋白表達(dá)，抑制核NF-κBp65蛋白和減少下游MCP1、NCF2等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，顯著抑制肝小葉性炎癥。結(jié)論：不同強(qiáng)度有氧運動可抑制大鼠體重的增加，從而減少因高脂飲食導(dǎo)致的大鼠肝臟脂質(zhì)沉積；較大強(qiáng)度有氧運動可顯著性抑制大鼠NAFLD向NASH方向轉(zhuǎn)化，其機(jī)制與促進(jìn)肝細(xì)胞SIRT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，小強(qiáng)度有氧運動抑制大鼠NASH效果不顯著。

有氧運動；非酒精性脂肪肝炎；脂聯(lián)素；SIRT1；NF-κB

非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是單純性脂肪肝進(jìn)一步發(fā)展的結(jié)果，其病理表現(xiàn)為脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤、肝組織壞死和纖維化病變[13]。隨著世界范圍內(nèi)NASH的發(fā)病率日益升高，NASH已成為頗受關(guān)注的公共健康問題之一。目前，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)向NASH轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制尚不清楚，但肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和促炎因子的生成被認(rèn)為是導(dǎo)致NASH的重要因素[13]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[20](核轉(zhuǎn)錄因子κB)是促炎因子生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，激活后導(dǎo)致下游相關(guān)炎性因子如MCP1(單核細(xì)胞化學(xué)趨化因子1)、NCF2(嗜中性粒細(xì)胞胞質(zhì)因子2)等的表達(dá)，從而募集肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞、血循環(huán)的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集和釋放炎性因子，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致肝實質(zhì)細(xì)胞損傷和肝小葉性炎癥。組蛋白去乙?；窱(SIRT1)是NF-κB的上游蛋白，通過去乙酰化作用而抑制NF-κB的活性，抑制炎性反應(yīng)的生成，而研究表明[38]，NASH肝組織SIRT1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致或促進(jìn)脂肪性肝炎的發(fā)生[17]。

有氧運動能抑制或改善NAFLD病理進(jìn)展，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和減少肝臟脂質(zhì)沉積[41,47]。目前，有關(guān)運動對NASH肝內(nèi)炎性信號通路的影響尚不清楚，不同強(qiáng)度的有氧運動對NASH大鼠肝炎的影響也未見報道。所以，本研究探討不同強(qiáng)度有氧運動對NASH大鼠肝細(xì)胞內(nèi)炎性因子調(diào)控通路的影響。研究假設(shè)中等強(qiáng)度、較大強(qiáng)度有氧運動通過增加高分子量脂聯(lián)素(HMW脂聯(lián)素)的分泌，促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1的表達(dá)和活性，抑制NF-κB炎性通路，緩解肝小葉脂質(zhì)性炎癥的進(jìn)展。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗對象與運動方案

健康雄性SPF級6周齡SD大鼠50只(購自廣東中醫(yī)藥大學(xué)動物中心)，體重150～160 g。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：普通安靜組(Normal Diet Group,ND)、高脂安靜對照組(High Fat Diet Control Group,C)、高脂小強(qiáng)度運動組(High Fat Diet with Low Intensity Exercise Group,LE)、高脂中等強(qiáng)度運動組(High Fat Diet with Middle Intensity Exercise Group,ME)和高脂遞增負(fù)荷運動組(High Fat Diet with Incremental Intensity Exercise Group,IE)，每組各10只。各組分籠飼養(yǎng)于動物室中，每籠4～5只。動物室環(huán)境溫度22℃～26℃，明暗周期為12 h(7：00～19：00)。實驗期間，ND組給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料，共計16周。大鼠的普通飼料和高脂飼料均購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，其中，普通飼料采用美國營養(yǎng)學(xué)會推薦的AIN 93G配方(適合生長期)，營養(yǎng)成份按能量比例計算，碳水化合物占64%、脂肪16.7%、蛋白質(zhì)19.3%；高脂飼料的總熱量約為506 kcal/100 g，營養(yǎng)成份按能量比例計算，脂肪占59.5%、蛋白質(zhì)19.7%、碳水化合物20.8%。建模期間隔周取鼠尾靜脈血2 ml左右測定血脂(TC、TG、LDL-C)和血ALT，監(jiān)測建模進(jìn)展，于第10周末隨機(jī)抽取高脂組大鼠兩只，麻醉后取完整肝稱重，剪下肝左葉部分組織行常規(guī)固定、脫水和石蠟包埋，切片后HE染色，病理診斷結(jié)合高脂組大鼠正常的血ALT水平，確認(rèn)此時高脂組大鼠已發(fā)生非酒精性單純性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver,NAFL)，尚未進(jìn)入NASH階段。

1.2 實驗取材

第16周完成最后一次跑臺運動后取材。無菌操作下，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，沿大鼠腹部正中線剪開腹腔，充分暴露腹膜后腹主動脈，采血置于分離膠采血管內(nèi)，于室溫下靜置數(shù)分鐘。放置高速冷凍離心機(jī)內(nèi)4 ℃、3 500 rpm離心15 min，取血清，一部分用于測試血脂、ALT、總脂聯(lián)素、高分子量脂聯(lián)素(HMW脂聯(lián)素)等；另一部分血清各組分別等比例混合，0.22 μm濾過除菌，分裝，用于BRL-3A肝細(xì)胞培養(yǎng)，所取血清均于-80 ℃保存。完整取出肝臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸濕后，于肝臟中葉的中間部位切取1 cm×1 cm×1 cm大小的肝組織，用濾紙拭干血跡后于10%甲醛溶液中固定保存，用于HE染色切片；另取部分肝中葉切塊分裝于凍存管，置于液氮罐備用。

1.3 BRL-3A肝細(xì)胞培養(yǎng)和處理

大鼠BRL-3A肝細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物研究所，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，于37 ℃、5% CO2環(huán)境孵育，每毫升培養(yǎng)液中含1×106個肝細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加2 ml細(xì)胞懸液。第2天待細(xì)胞貼壁后換用無血清的DMEM培養(yǎng)液，24 h后加入10%的ND、C、LE、ME、IE組大鼠血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收獲，提取總RNA。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)的測定

大鼠血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)通過全自動生化分析儀測定(7020全自動生化分析儀，HITACH公司)；血清總脂聯(lián)素和HMW脂聯(lián)素通過ELISA試劑盒檢測(試劑盒分別購于Bluegene和Shibayaji公司)。

1.4.2 肝組織勻漿測定SOD活性、MDA水平

于0℃～4℃冰浴中，將1 g左右肝組織加入適量生理鹽水搗碎，用電動攪伴器帶動的玻璃勻漿器制成10%組織勻漿；1 000 g離心10 min，取上清液備用。采用考馬斯亮藍(lán)法，于722分光光度計上按照試劑盒說明書要求測定肝組織勻漿的蛋白含量。制備肝組織勻漿后，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、硫代巴比妥酸法測定MDA水平(兩者試劑盒均購于南京建成生物公司)。

1.4.3 肝組織HE染色切片病理學(xué)檢查

取部分肝左葉，常規(guī)固定脫水，石蠟包埋、切片后HE染色；采用雙盲法，對光鏡下肝脂肪變性、氣球樣變、小葉性炎癥、活動度積分(NAFLD activity score,NAS)進(jìn)行評估，并對肝纖維化進(jìn)行分期。

1.4.4 Real Time PCR測定大鼠肝組織SIRT1、PPARα、MCP1和NCF2mRNA以及BRL-3A肝細(xì)胞SIRT1和Adipnectin R2mRNA的表達(dá)

Trizol一步法提取肝臟、BRL-3A肝細(xì)胞總RNA，并對總RNA進(jìn)行濃度、純度和完整性的檢測。反轉(zhuǎn)錄后，在CFX96 realtime PCR儀(Bio-Rad公司)上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。SIRT1、PPARα、脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)、MCP1、NCF2的cDNA擴(kuò)增引物見表1。PCR反應(yīng)條件，擴(kuò)增曲線階段： 95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s，40個循環(huán)；融解曲線階段：融解溫度區(qū)間為55 ℃～95 ℃，讀數(shù)間隔為0.5 ℃，每次持續(xù)時間為2 s。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算各樣品目的基因的相對表達(dá)量。

表 1 本研究引物合成序列一覽表

1.4.5 Western Blot法測定肝組織SIRT1、核NF-κBp65蛋白表達(dá)

分別提取總蛋白和核蛋白后測定蛋白濃度，根據(jù)測定的蛋白濃度和上樣蛋白40 μg計算上樣量。用12%丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白及內(nèi)參蛋白(測定總蛋白的內(nèi)參蛋白為 GADPH，測定核蛋白的內(nèi)參蛋白為Histone-1，分別購于江蘇碧云天公司和上海艾博抗公司)。將平行膠一塊用于考馬斯藍(lán)染色，確定電泳效果，另一塊進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。將轉(zhuǎn)印槽陰極平放工作臺上，在上面加3張電轉(zhuǎn)印液浸透的1 mm厚的濾紙，將用電轉(zhuǎn)印液預(yù)浸透15 min的0.45 μm硝酸纖維素膜(NC膜)放在濾紙上，再將凝膠平放在NC膜上，最后在凝膠上加蓋3層電轉(zhuǎn)印液浸透約1 mm厚的濾紙，接通電源，100 V、1 h電轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，卸下電泳裝置，把硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜放入盛有10%脫脂奶粉封閉液中，封閉2 h。封閉完畢后用PBST洗膜5 min×5。加一抗(SIRT1 1∶1 000、NF-κBp65 1∶500稀釋，均購于江蘇碧云天公司)，室溫1 h，搖床。PBST洗膜5 min×5，加1∶1 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(購于江蘇碧云天公司)，室溫孵育1 h，搖床。PBST洗膜5 min×5，將NC膜浸泡于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，室溫孵育3～5 min；用濾紙將NC膜表面液體擦干，置于暗室，用X光底片覆蓋，曝光1 min，常規(guī)方法顯影定影，Gel軟件進(jìn)行圖像分析。1.4.6 核磁共振正反相位技術(shù)(IP/OP MRI)對肝脂質(zhì)含量進(jìn)行半定量檢測

實驗結(jié)束前2天，每組隨機(jī)選取任意6只大鼠進(jìn)行IP/OP MRI檢查，禁食、禁水12 h，無菌操作下腹腔內(nèi)注射7%水合氯醛(0.2 ml /100 g weight)對大鼠進(jìn)行麻醉，以仰臥位將大鼠放置于專用體線圈內(nèi)，肝臟置于線圈中心位置。采用GE Sigma 3.0T HD磁共振掃描儀，常規(guī)T1W、T2W平掃作為后續(xù)序列的定位。梯度回波雙回波 T1W In Phase/Out Phase序列主要掃描參數(shù)：TR70ms，TE 4.6ms(IP)/6.9ms(OP)，Nex：12.0，b：0.0，掃描時間120 s。同一大鼠一次掃描同時獲取同、反相位信號。在中心體素的左、中、右3個位置選取10 mm2圖像為感興趣區(qū)(Region of interest,ROI)進(jìn)行信號分析，分別測量3個ROI在In Phase和Out Phase上的信號強(qiáng)度(Signal intensity,SI)，通過二者之間的差值(SIin-SIout)計算出肝臟脂肪變異指數(shù)(fat index,FI)(FI=SIin-SIout/SIin)[12]，取3個ROI的FI平均值作為整個肝臟脂肪變異程度的量化指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 不同強(qiáng)度有氧運動對大鼠體重、血脂、血ALT和血脂聯(lián)素的影響

實驗結(jié)束時，各組大鼠體重均有不同程度的增長，C組體重顯著性高于運動各組和普通對照組(P<0.01)，而運動各組之間體重?zé)o顯著性差異；運動組血脂、ALT較C組顯著性下降，且IE組ALT顯著性低于LE組(P<0.05)；運動各組血脂之間無顯著性差異；C組血清總脂聯(lián)素和HMW脂聯(lián)素較ND組顯著性減少(P<0.01)，而運動各組總脂聯(lián)素較C組顯著性增加，ME、IE組HMW脂聯(lián)素較C組和LE組顯著性增加(P<0.05)，并且IE組HMW脂聯(lián)素顯著性高于ME組(P<0.05)。

房產(chǎn)行業(yè)是當(dāng)今社會的熱門行業(yè)，隨著房價的持續(xù)走高，人們對房子的質(zhì)量及建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)的要求越來越高。而在房產(chǎn)企業(yè)的運營中，房產(chǎn)測繪工作有十分重要的現(xiàn)實意義。測繪人員在進(jìn)行房產(chǎn)測繪工作的過程中，通常會使用一些測繪工具或高科技儀器，從而保證測繪工作的順利進(jìn)行以及測繪成果的質(zhì)量。房產(chǎn)測繪工作完成后，技術(shù)人員通過對所得數(shù)據(jù)信息的處理及分析，明確該處房產(chǎn)的管理權(quán)限，稅收標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)權(quán)擁有等情況[2]。另外，房產(chǎn)測繪工作還能為當(dāng)?shù)卣块T進(jìn)行土地規(guī)劃提供有效的數(shù)據(jù)參考。

圖 1 本研究實驗后6周各組大鼠體重變化趨勢示意圖

表 2 本研究大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和脂質(zhì)的變化一覽表

表 3 本研究血清總脂聯(lián)素和高分子量脂聯(lián)素變化一覽表

2.2 不同強(qiáng)度有氧運動對肝SOD、MDA含量的影響

C組肝組織MDA較ND組顯著性增加，SOD顯著性減少(P<0.05)；而運動各組肝組織MDA較C組顯著性減少(P<0.05)，而SOD顯著性增加；隨著運動強(qiáng)度的增加，運動組肝組織SOD有升高的趨勢，且IE較LE組肝組織SOD活性顯著性升高(P<0.05)；運動各組之間肝組織MDA水平無顯著性差異。

表 4 本研究肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較一覽表

2.3 不同強(qiáng)度有氧運動對肝SIRT1、PPARα、MCP1、NCF2mRNA表達(dá)的影響

Real Time PCR結(jié)果顯示，與ND組比較，C組MCP1、NCF2mRNA表達(dá)顯著性升高(P<0.01)，而PPARα、SIRT1mRNA表達(dá)顯著性減少(P<0.01)；與C組相比，運動各組PPARα、SIRT1mRNA表達(dá)均顯著性增加；ME和IE組MCP1、NCF2mRNA表達(dá)較C組顯著性下降，而LE組MCP1、NCF2mRNA表達(dá)與C組無顯著性差異；運動各組之間，IE組SIRT1、PPARαmRNA表達(dá)顯著性高于LE和ME組，MCP1mRNA表達(dá)顯著性低于LE和ME組(P<0.01，P<0.05)，并且NCF2mRNA表達(dá)顯著性低于LE組(P<0.05)；ME組SIRT1、PPARαmRNA表達(dá)顯著性高于LE組(P<0.01)。

圖 2 本研究不同強(qiáng)度有氧運動對肝組織SIRT1、PPARα、NCF2、MCP1mRNA表達(dá)的影響示意圖

2.4 不同強(qiáng)度有氧運動對肝SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果表明，C組SIRT1蛋白表達(dá)較ND組顯著性減少(P<0.01)，而核NF-κB蛋白表達(dá)較ND組顯著性升高(P<0.01)；運動各組肝SIRT1蛋白表達(dá)均不同程度的升高，核NF-κB蛋白表達(dá)均不同程度地受抑制，其中LE組的SIRT1蛋白表達(dá)與C組之間無顯著性差異；ME和IE組SIRT1和核NF-κB蛋白表達(dá)與C組、LE組相比有顯著性差異； IE組在SIRT1蛋白表達(dá)較LE、ME組顯著性增加(P<0.01，P<0.05)，而核NF-κB蛋白表達(dá)較LE、ME組顯著性減少(P<0.01，P<0.05)。

圖 3 本研究不同強(qiáng)度有氧運動對肝組織SIRT1、核NF-κB蛋白表達(dá)的影響示意圖

注：與C組相比，* P<0.05，** P<0.01；與LE組相比 # P<0.05；與ME組相比 $ P<0.05。

為初步確定不同強(qiáng)度有氧運動對NASH大鼠肝臟SIRT1軸影響的分子機(jī)制，本研究用大鼠血清孵育BRL-3A肝細(xì)胞48 h，觀察對細(xì)胞SIRT1、AdipoR2mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞AdipoR2mRNA表達(dá)上，LE血清孵育后BRL-3A細(xì)胞AdipoR2mRNA表達(dá)較C組血清孵育無顯著性變化，而ME和IE血清孵育后AdipoR2mRNA表達(dá)較C和LE血清孵育有顯著性增加(P<0.05)；肝細(xì)胞SIRT1 mRNA表達(dá)上，C組血清孵育后BRL-3A肝細(xì)胞SIRT1 mRNA表達(dá)較ND組顯著性減少(P<0.01)，LE血清孵育與C組血清孵育比較無顯著性差異，而ME和IE組血清孵育較C組和LE組血清孵育顯著性增加(P<0.01)，且IE組顯著性高于ME組(P<0.05)。

2.6 肝組織石蠟切片HE染色結(jié)果

參照美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南，對實驗各組大鼠進(jìn)行常規(guī)NAS和肝纖維化分期[23,24]，指南規(guī)定NAS(0～8分)包括3個方面：即肝細(xì)胞脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變性。其中，肝細(xì)胞脂肪變性分為0分(<5%)、1分(5%～33%)、2分(34%～66%)、3分(>66%)；小葉內(nèi)炎癥分為0分(無壞死灶)、1分(壞死灶個數(shù)<2個)、2分(壞死灶個數(shù)2～4個)、3分(壞死灶個數(shù)>4個)；肝細(xì)胞氣球樣變性分為0分(無)、1分(少見)、2分(多見)。NAS<3分可排除NASH，為非酒精性脂肪肝(NAFL)階段；NAS>4分即可診斷NASH；介于兩者之間為NASH可疑。此外，肝纖維化分為5期，0期：無纖維化；1a期：肝腺泡3區(qū)輕度竇周纖維化，1b期：肝腺泡3區(qū)中度竇周纖維化，1c期：僅有門脈周圍纖維化；2期：腺泡3區(qū)竇周纖維化合并門脈周圍纖維化；3期：橋接纖維化；4期：高度可疑或確認(rèn)肝硬化。光鏡下，C組大鼠肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞索境界不清，彌漫性脂質(zhì)空泡，且大小不等，肝細(xì)胞氣球樣變多見，大囊泡廣泛分布，且肝小葉內(nèi)壞死性灶較多，部分具有1a纖維化變，平均NAS為8分，結(jié)果說明，該組全部大鼠已進(jìn)展至NASH階段。光鏡下，運動各組肝脂肪變性較C組減輕，且未見纖維化變。LE組肝細(xì)胞氣球樣變?nèi)远嘁姡?只大鼠肝小葉內(nèi)有< 2個的壞死灶，2只大鼠肝小葉內(nèi)有>4個的壞死灶，組平均NAS為5.4分，結(jié)果表明，LE組中7只大鼠已進(jìn)展至NASH階段，2只處于NASH可疑階段；ME組肝細(xì)胞氣球樣變較C組和LE組顯著性減少(P<0.05)，僅3只大鼠肝小葉內(nèi)可見<2個的壞死灶，組平均NAS為3.4分，結(jié)果顯示，ME組中1只大鼠處于NAFL階段，6只大鼠處于NASH可疑階段，1只大鼠進(jìn)展至NASH階段；IE組肝細(xì)胞氣球樣變較C組和LE組顯著性減少(P<0.01)，僅2只大鼠肝小葉內(nèi)可見< 2個的壞死灶，余者肝小葉內(nèi)未見壞死灶，組平均NAS為2.8分，結(jié)果表明，該組有4只大鼠處于NAFL階段，5只大鼠處于NASH可疑階段。

圖 5 本研究HE染色肝組織切片鏡下圖像圖

圖 6 本研究實驗各組肝組織病理學(xué)診斷示意圖

2.7 IP/OP MRI對實驗各組肝脂質(zhì)含量的半定量檢測結(jié)果

IP/OP MRI可對NAFLD大鼠肝脂質(zhì)含量進(jìn)行半定量分析[12]，與肝組織HE染色切片的病理診斷相配合，能對肝脂質(zhì)含量進(jìn)行更為準(zhǔn)確的半定量判斷[6,8]。IP/OP MRI結(jié)果顯示，運動各組FI系數(shù)較C組均顯著性減少，ME、IE組FI系數(shù)顯著性低于LE組(P<0.05)；IE組低于ME組但無顯著性差異。

3 討論

有氧運動能減少肥胖小鼠血清ALT和肝組織脂肪沉積[37]，并具有其他多種健康效應(yīng)，如減體重、改善機(jī)體胰島素抵抗等，故現(xiàn)在已將有氧運動作為治療脂肪肝的主要手段之一。運動除通過減少體重而間接影響肝臟物質(zhì)代謝外，也能直接影響肝細(xì)胞的生物學(xué)功能，如在OLETF大鼠實驗中[44]，運動可增加大鼠肝細(xì)胞脂肪酸氧化、減少細(xì)胞內(nèi)新生的脂肪酸、抑制肝臟脂質(zhì)沉積，改善細(xì)胞對胰島素的敏感性。目前有關(guān)有氧運動是否能抑制NAFLD向NASH轉(zhuǎn)化的研究較少[18]，具體機(jī)制也不清楚。本研究中高脂各組經(jīng)過10周60%高脂飼料喂養(yǎng)后，根據(jù)隨機(jī)抽取的大鼠肝組織病理學(xué)診斷以及動態(tài)監(jiān)測血ALT正常水平，綜合判斷高脂各組發(fā)生不同程度的單純性肝脂肪變性，但尚未進(jìn)入NASH階段。實驗結(jié)束時，根據(jù)各組HE切片的病理學(xué)診斷(確診NASH的最主要手段)、異常的血ALT水平以及IP/OP MRI對肝脂質(zhì)的半定量分析，確認(rèn)C組已進(jìn)入NASH階段；而運動各組與C組相比較表明，6周不同強(qiáng)度有氧運動均顯著抑制肝脂質(zhì)沉積，減少大鼠NAS，并且ME、IE組與LE組相比，肝小葉性炎癥和氣球樣變不同程度減輕，血ALT水平顯著性減少，并且IE組表現(xiàn)更顯著。結(jié)合運動各組體重?zé)o顯著性差異的現(xiàn)象，研究者認(rèn)為中等及較大強(qiáng)度有氧運動可抑制NAFLD大鼠肝炎性信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕肝小葉性炎癥表現(xiàn)。

圖 7 本研究實驗各組肝臟IP/OP MRI影像圖

表 5 本研究IP/OP MRI正反相位信號強(qiáng)度及FI系數(shù)一覽表

國外流行病學(xué)資料[30,31]表明，較大強(qiáng)度的有氧運動和疾病的致死率之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性，如心血管疾病、結(jié)腸癌等，但目前國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。資料顯示[50]，有氧運動強(qiáng)度和臨床心血管疾病的實驗室數(shù)據(jù)之間呈現(xiàn)良好的一致性，而且男性較女性更明顯，男性進(jìn)行較大強(qiáng)度有氧運動可以比中等強(qiáng)度有氧運動更顯著地減少心血管疾病的發(fā)生率，如冠心病[48]。臨床病歷的專家隨訪研究中[51]，發(fā)現(xiàn)僅僅只有較大強(qiáng)度的有氧運動可以預(yù)防和減少心肌梗塞的發(fā)病率，而中等強(qiáng)度的有氧運動卻沒有預(yù)防效應(yīng)。除了心血管疾病外，針對男性患者的長期追蹤研究[33,34,58]表明，較大強(qiáng)度有氧運動可以減少多種病因所導(dǎo)致的致死率；現(xiàn)在針對女性患者的運動方案往往采用的是中等強(qiáng)度有氧運動，采用較大強(qiáng)度的研究報道[36]目前仍較少。所以，針對我國的目標(biāo)人群來說，當(dāng)前運動處方中經(jīng)常采用的中等強(qiáng)度是否是最佳的選擇？被認(rèn)為可能有危險性的較大強(qiáng)度有氧運動，是否可以應(yīng)用于相關(guān)疾病的輔助治療的運動方案中，值得進(jìn)一步深入研究。

通過評價不同強(qiáng)度有氧運動對脂肪肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1軸的影響，探討小、中、較大強(qiáng)度有氧運動對脂肪肝細(xì)胞炎性狀態(tài)以及炎性信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度有氧運動對大鼠HWM脂聯(lián)素影響的差異可能是導(dǎo)致有氧運動干預(yù)效果差異的重要原因之一，中等及較大強(qiáng)度有氧運動能促進(jìn)HWM脂聯(lián)素的分泌，促進(jìn)肝細(xì)胞SIRT1表達(dá)和活性，SIRT1的去乙酰化作用抑制核NF-κB蛋白活性，從而改善肝組織氧化應(yīng)激，減少炎性因子NCF1、MCP的生成，緩解大鼠脂肪肝炎的進(jìn)展。本研究首次發(fā)現(xiàn)，較大強(qiáng)度運動可顯著性抑制NAFLD大鼠肝組織轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)的炎性信號通路。

3.1 不同強(qiáng)度有氧運動對SIRT1-NF-κB-炎性因子信號通路的影響

本研究結(jié)果表明，中等以及較大強(qiáng)度運動能顯著增加HMW脂聯(lián)素水平、促進(jìn)肝細(xì)胞SIRT1基因和蛋白表達(dá)，抑制核NF-κB活性及其下游炎性細(xì)胞因子生成，抑制大鼠脂肪性肝炎的發(fā)展。

各種動物模型NASH研究表明[11,14,20]，在脂質(zhì)沉積和氧化應(yīng)激的“二次打擊”作用下，肝實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞的NF-κB激活和炎性因子的生成是炎性細(xì)胞聚集、誘導(dǎo)組織損傷的主要原因之一，NF-κB[25]被認(rèn)為是NASH生成的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究中肝組織HE切片及活動度評分表明，C組大鼠發(fā)生了NASH，并且核NF-κB蛋白表達(dá)、炎性細(xì)胞因子MCP1、NCF2基因表達(dá)顯著增加，表明肝組織內(nèi)炎性信號NF-κB和炎性細(xì)胞因子通路的激活。研究表明[25]，肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB激活是脂肪肝炎重要的始動因素；而非實質(zhì)性細(xì)胞如Kupffer細(xì)胞NF-κB的激活對脂肪肝炎起放大作用。因此，抑制肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB激活，有利于阻止NAFLD向NASH轉(zhuǎn)化。有研究[20]利用腺病毒轉(zhuǎn)染IκBα來抑制大鼠NF-κB的表達(dá)，可顯著阻止MCD飲食導(dǎo)致的脂肪性肝炎的生成，降低血清ALT、減輕肝小葉炎癥。

肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1是NF-κB的上游調(diào)節(jié)因子，可去乙?；疦F-κB p65 Lys310殘基，從而抑制NF-κB的反式激活能力[28,56,57]；敲除SIRT1基因可導(dǎo)致非酒精性脂肪肝和肝炎的發(fā)生[42]，而SIRT1的過表達(dá)可以抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子及其下游炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制脂肪肝炎的生成[40]，所以SIRT1已成為NAFLD和NASH重要的治療靶點[17]。與眾多研究相一致[3,16,21,42,54]，本研究中高脂飲食下，C組大鼠肝細(xì)胞SIRT1表達(dá)顯著性減少，核NF-κB 表達(dá)顯著性增加。有氧運動可以促進(jìn)肝組織SIRT1的表達(dá)[22]，但本研究結(jié)果表明，小強(qiáng)度運動組肝細(xì)胞SIRT1基因表達(dá)雖較C組增加，但SIRT1蛋白表達(dá)與C組無顯著性差異，并且核NF-κB蛋白表達(dá)以及NFR2、MCP1表達(dá)較C組無顯著性減少，說明小強(qiáng)度有氧運動對NASH大鼠肝細(xì)胞SIRT1-NF-κB-炎性因子軸無顯著性影響；ME、IE組肝細(xì)胞SIRT1基因和蛋白表達(dá)較C組均顯著性增加，尤以IE組SIRT1蛋白和基因的表達(dá)最顯著，SIRT1蛋白表達(dá)與運動強(qiáng)度之間表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。所以，中等和較大強(qiáng)度有氧運動能顯著激活肝細(xì)胞SIRT1軸，抑制肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白介導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞因子，骨骼肌也能參與分泌，它具有促進(jìn)機(jī)體糖脂代謝、提高組織胰島素敏感性等重要作用。哺乳動物血清脂聯(lián)素一般以3種聚合形式存在，即三聚體(LMW)、六聚體(MMW)和多聚體(HMW)。研究表明[9,39]，HMW脂聯(lián)素水平可較好反映非酒精性脂肪肝程度，HMW脂聯(lián)素對肝組織具有特異性作用[26]。Waki H等[55]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脂聯(lián)素分子氨基端Cys被Ser取代，分子內(nèi)二硫鍵的形成被破壞，球形脂聯(lián)素和全長形脂聯(lián)素不能聚合成HMW脂聯(lián)素，而缺少HMW的脂聯(lián)素激活肝細(xì)胞SIRT1的能力被顯著性抑制。運動能促進(jìn)骨骼肌、脂肪組織分泌脂聯(lián)素，增加組織脂聯(lián)素受體的表達(dá)[19,43,45]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD大鼠具有較低的血脂聯(lián)素水平[38]，而肝細(xì)胞SIRT1是脂聯(lián)素受體的下游蛋白[49]。本研究結(jié)果表明，中等強(qiáng)度及以上的有氧運動可以促進(jìn)NAFLD大鼠血HMW脂聯(lián)素的增加，而較大強(qiáng)度的遞增負(fù)荷運動效果最顯著，也有研究報道，血清脂聯(lián)素以及HMW脂聯(lián)素與運動強(qiáng)度之間呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系[29,43]。綜上所述，3組不同強(qiáng)度有氧運動下，大鼠脂肪肝細(xì)胞SIRT1表達(dá)和活性的差異和HMW脂聯(lián)素水平密切有關(guān)。此外，如同饑餓和禁食[15,46]，有氧運動導(dǎo)致肝組織內(nèi)SIRT1活性的變化也與血糖水平等其他因素相關(guān)。

本研究細(xì)胞實驗初步證明了有氧運動能促進(jìn)大鼠肝細(xì)胞脂聯(lián)素/SIRT1信號傳導(dǎo)的作用。利用運動后ME和IE組大鼠血清孵育BRL-3A大鼠肝細(xì)胞后，AdipoR2和SIRT1mRNA表達(dá)增加，這與文獻(xiàn)報道[49]相一致，說明：1)HMW脂聯(lián)素與肝細(xì)胞SIRT1基因表達(dá)密切相關(guān)；2)HMW脂聯(lián)素、AdipoR2、SIRT1之間可能存在著正反饋現(xiàn)象，促進(jìn)肝細(xì)胞AdipoR2基因的表達(dá)[35]。此外，不同組別血清孵育BRL-3A細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞AdipoR2、SIRT1mRNA表達(dá)的顯著性差異可能也與血乳酸、瘦素等[27]其他因素的水平變化有關(guān)。圖8總結(jié)了中等及較高強(qiáng)度有氧運動可能通過HMW脂聯(lián)素-SIRT1軸抑制NF-κB介導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制脂肪性肝炎進(jìn)展的機(jī)制。

3.2 不同強(qiáng)度有氧運動對肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

目前有關(guān)不同強(qiáng)度的有氧運動對肝臟氧化應(yīng)激的影響報道不盡一致，有的認(rèn)為，運動強(qiáng)度的加大會增加肝細(xì)胞的凋亡百分率，袁海平等[7]發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度運動后即刻大鼠肝細(xì)胞凋亡增加，而且大強(qiáng)度運動后肝細(xì)胞凋亡的百分率顯著增大；陳偉等[1]發(fā)現(xiàn)大強(qiáng)度力竭運動后12 h肝細(xì)胞凋亡增加顯著，且中等以上強(qiáng)度的力竭運動更易引起肝細(xì)胞凋亡；劉文峰等[4]發(fā)現(xiàn)，模擬4 000 m的高住低練對大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響比單純低氧暴露和常氧運動大，但同時也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞增殖也呈增加趨勢。也有相反的研究報道認(rèn)為較大強(qiáng)度有氧運動能改善肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，減少肝細(xì)胞凋亡水平。程麗彩等[2]研究發(fā)現(xiàn)，長期耐力運動可顯著性減少大鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，降低肝細(xì)胞凋亡率，認(rèn)為長期的體育運動后肝臟出現(xiàn)了代償性的適應(yīng)；羅艷蕊等[5]研究6周的高脂飼料喂養(yǎng)后，大鼠肝Bax/Bcl-2顯著性升高，大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著性增加，而6周無負(fù)重游泳運動可顯著性降低大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，中等強(qiáng)度游泳運動降低肝細(xì)胞凋亡率更顯著。本研究也發(fā)現(xiàn)，6周有氧運動后，運動各組肝組織MDA顯著性減少，SOD顯著性增加，血ALT較C組均顯著性減少，表明不同強(qiáng)度有氧運動均能改善脂肪肝組織氧化應(yīng)激；各組之間肝功能酶ALT水平的差異表明，中等、較大強(qiáng)度運動比小強(qiáng)度運動在緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝功能損傷方面作用更顯著。研究者認(rèn)為，一次大強(qiáng)度或力竭性運動會促進(jìn)肝組織的急性氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡增加；而長期適應(yīng)性的中等或較大強(qiáng)度有氧運動可降低肝組織的氧化應(yīng)激水平，減少肝細(xì)胞凋亡。

圖 8 有氧運動抑制NAFLD大鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB介導(dǎo)的炎性信號通路示意圖

研究表明[52]轉(zhuǎn)錄因子PPARα促進(jìn)SOD、過氧化物酶等抗氧化酶基因的表達(dá)，提高肝實質(zhì)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力。本研究中不同強(qiáng)度有氧運動均能顯著增加PPARα基因表達(dá)，并且與運動強(qiáng)度之間有劑量依賴現(xiàn)象；SIRT1能去乙?；疨PARα，促進(jìn)其活性增加[15]，本研究中SIRT1與運動強(qiáng)度之間的劑量依賴現(xiàn)象，表明有氧運動也可能通過肝SIRT1軸調(diào)節(jié)NASH大鼠肝的抗氧化應(yīng)激水平。由于小強(qiáng)度有氧運動對大鼠肝內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)無顯著性影響，所以小強(qiáng)度有氧運動可能通過其他通路調(diào)節(jié)肝抗氧化能力。有關(guān)不同強(qiáng)度有氧運動對NAFLD大鼠肝抗氧化能力的影響值得后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

4 小結(jié)

有氧運動能抑制因高脂飲食所導(dǎo)致的大鼠肝脂質(zhì)沉積，降低NAFLD活動度評分，對NAFLD起著輔助治療作用；較大強(qiáng)度有氧運動在抑制大鼠單純性脂肪肝向脂肪肝炎轉(zhuǎn)化的效果方面作用顯著，其機(jī)制與激活肝細(xì)胞HMW脂聯(lián)素/SIRT1/NF-κB信號通路，抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，減少炎性細(xì)胞在肝組織的聚集，減輕炎性反應(yīng)有關(guān)。

5 結(jié)論

本次動物實驗說明，有氧運動的運動強(qiáng)度與NASH發(fā)病機(jī)制之間有著密切的聯(lián)系，小強(qiáng)度有氧運動對抑制NASH形成的作用并不顯著，而適應(yīng)性的較大強(qiáng)度有氧運動可激活肝細(xì)胞SIRT1信號通路，從而抑制大鼠非酒精性脂肪肝炎的形成。本研究提示，針對不同性別、年齡、身體狀況NAFLD患者的運動處方的制定中，較大運動強(qiáng)度的選擇問題值得進(jìn)一步深入研究。

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DiscussiononEffectsofDifferentAerobicExerciseIntensitiesontheHepatitisofNAFLDRatsBasedontheSIRT1Axis

ZHAO Jun1,2,ZHAO Mei-qin3,SHI Chang-zheng4,CHEN Hong-hui2

Objective:To study how the aerobic exercise of different intensity has therapy effect on nonalcoholic steatohepatitis of rats model.Methods:Randomly divide the fifty Sprague Dawley rats into Normal Diets group (ND),High Fat Diet Control group (C),High Fat Diet Low Intensity Exercise group (LE),High Fat Diet Middle Intensity Exercise group (ME) and High Fat Diet Incremental intensity Exercise group (IE),10 rats in each group.The ND group is feed normal diet and the other groups are high fat diet for 16 weeks.Every exercise groups start to run on the animal treadmill since the 11th week during the experiment for 6 weeks.At the end of test,the rat’s abdominal aortic blood was to measure the level of ALT,blood fat and adiponectin,morphology of hepatic tissue was observed,the level of SOD,MDA in hepatocytes was assayed and the mRNA of SIRT1,MCP1,NCF2 was measured,and the fat content in liver was observed by PI/OP MRI,as well as the protein expression of SIRT1 and nuclear NF-κB in hepatocyte.Results:The nonalcoholic steatosis hepatitis and hepatic fibrosis was occured in the C group after 16 weeks high-fat feeding.However,three types of exercise intensity could ameliorate the lipid deposition and the state of oxidative stress in liver.Compared to the low intensity exercise,middle and incremental intensity exercise could significantly increase the level of serum HWM adiponectin and the protein expression of SIRT1 in hepatocyte,supress the protein expression of NF-κB in nucleus and its downstream such as MCP1 and NCF2mRNA expression in hepatocyte,so impede the occur of lobuler hepatitis.Conclusion:All three different intensities of aerobic exercise could supress the lipid accumulation in rats liver through weight reduction mechnism.Vigorous aerobic exercise profoundly restrain the transition of NAFLD to NASH of rats through SIRT1 signal transduction axis in hepatocyte,but low intensity of aerobic exercise couldn’t.

aerobicexercise;nonalcoholicsteatohepatitis;adiponectin;SIRT1;NF-κB

1000-677X(2014)11-0050-10

2014-06-01；

：2014-10-16

湖南省體育科學(xué)學(xué)會資助項目(KT13-011)。

趙軍(1971-)，男，湖北宜昌人，副教授，博士，主要研究方向為營養(yǎng)與運動生物化學(xué)，Tel：(020)85220282，E-mail:870835676@qq.com。

1.暨南大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程博士后流動站，廣東 廣州 310630；2.暨南大學(xué) 體育部，廣東 廣州 310630；3.武漢西藏中學(xué)，湖北 武漢 430083；4.暨南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 310630 1.Biology Medical Engineering Postdoctoral Research Station,Jinan University,Guangzhou 510630,China;2.Jinan University,Guangzhou 510630,China;3.Tibet Middle School,Wuhan 430083,China;4.The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510630,China.

G804.7

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