杜宇翔 郭大東 唐凱 司俊康 沙芳 畢宏生

氯化鋅對紫外線損傷的人晶狀體上皮細胞的保護作用△

杜宇翔 郭大東 唐凱 司俊康 沙芳 畢宏生

鋅離子；晶狀體上皮細胞；紫外線；caspase-12

目的研究適當(dāng)濃度的ZnCl2對紫外線(ultraviolet B，UVB)損傷的人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cell，HLEC)的保護作用及其作用機制。方法用MTT法檢測空白對照組、單純紫外照射組和2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1ZnCl2預(yù)處理后UVB照射(實驗組)HLEC B-3的生存率； 實時細胞電子分析系統(tǒng)(RT-CES)動態(tài)監(jiān)測ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)預(yù)處理對UVB照射后HLEC B-3細胞增殖的影響；DAPI染色法檢測各組細胞核的變化；實時熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HLEC B-3中caspase-12 mRNA和蛋白質(zhì)表達的變化。結(jié)果MTT結(jié)果表明，單純紫外照射組和ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)預(yù)處理實驗組24 h細胞生存率分別為34.47%±9.31%、65.91%±12.46%、64.30%±16.24%和46.36%±6.28%；48 h細胞生存率分別為8.31%±1.38%、53.82%±11.34%、59.25%±7.58%和36.57%±8.41%；72 h細胞生存率分別為6.75%±3.71%、48.29%±10.06%、56.53%±8.47%和39.57%±8.93%。RT-CES分析結(jié)果顯示，ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)預(yù)處理可抑制UVB照射誘發(fā)的HLEC B-3的壞死和凋亡；DAPI染色結(jié)果表明，ZnCl2可減少UVB照射引起的HLEC B-3細胞核固縮和碎裂；RT-PCR和ELISA檢測結(jié)果表明，ZnCl2可抑制UVB照射誘發(fā)的caspase-12 mRNA和蛋白質(zhì)的表達升高。結(jié)論適當(dāng)濃度的ZnCl2可抑制UVB照射后HLEC B-3中caspase-12的表達上調(diào)，進而對體外培養(yǎng)的HLEC B-3細胞UVB損傷起到保護作用。

[眼科新進展，2014，34(5)：405-409]

鋅離子是機體重要的微量元素，參與了多種酶功能的調(diào)節(jié)，同時對千余種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能起調(diào)控作用[1]。前期的研究結(jié)果表明，鋅離子濃度的升高可以抑制細胞凋亡，對雙氧水[2]和高糖[3]引起的氧化應(yīng)激細胞損傷具有保護作用。紫外線(ultraviolet B，UVB)照射引發(fā)的細胞損傷本質(zhì)上也是一種氧化應(yīng)激。晶狀體上皮細胞是位于前囊下的單層上皮細胞，為晶狀體的生長和分化提供能量，同時參與晶狀體的損傷修復(fù)，與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究將就ZnCl2對UVB照射后的人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cell，HLEC)B-3的保護作用及其相關(guān)機制進行研究，以期對后續(xù)的研究工作提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器HLEC B-3(美國ATCC)；胎牛血清、改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、2.5 g·L-1胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)(美國 Hyclone公司)；DAPI(武漢博士德生物工程有限公司)，MTT(碧云天生物技術(shù)研究所)；TRIpure Reagent RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；caspase-12及GAPDH上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；人caspase-12酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢基因美生物技術(shù)有限公司)。實時熒光定量PCR(MX3000P，美國Agilent公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；熒光顯微鏡(IX71型，日本Olympus公司)；微量紫外分光光度計(K5600型，北京凱奧科技發(fā)展有限公司)。

1.2方法參照莊曉東等[4]的方法進行傳代培養(yǎng)HLEC B-3細胞株。培養(yǎng)液為含有青-鏈霉素、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的改良型1640細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期細胞隨機分為3組：(1)空白對照組：HLEC B-3未加入ZnCl2預(yù)處理，未經(jīng)UVB照射；(2)單純紫外照射組：HLEC B-3未加入ZnCl2預(yù)處理，棄除絕大部分細胞培養(yǎng)液，僅余少許等量培養(yǎng)液以防細胞干涸，40 mJ·cm-2UVB照射細胞；(3)ZnCl2實驗組：HLEC B-3分別用2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1的ZnCl2預(yù)處理2 h后，棄除絕大部分細胞培養(yǎng)液，僅余少許等量培養(yǎng)液以防細胞干涸，40 mJ·cm-2UVB照射細胞(UVB照射強度和ZnCl2處理濃度的選擇依據(jù)課題組前期的研究結(jié)果)，照射后繼續(xù)加入相應(yīng)濃度的ZnCl2培養(yǎng)細胞至需要時間。

1.2.1檢測ZnCl2對UVB照射后的HLECB-3細胞生長的影響

1.2.1.1MTT法取對數(shù)生長期的HLEC B-3細胞，按每孔8 000個密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，觀察細胞貼壁生長良好后按上述方法將HLEC B-3細胞分為空白對照組、單純紫外照射組和ZnCl2實驗組，按1.2中處理方法分別處理3組細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后各孔分別加入20 μL(5 g·L-1)MTT，孵育4 h棄去上層液體，加入DMSO后避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處進行檢測。實驗重復(fù)3次。

1.2.1.2實時細胞電子分析系統(tǒng)實時細胞電子分析系統(tǒng)(RT-CES)是一種以細胞指數(shù)(cell index，CI)值為測量值動態(tài)檢測細胞增殖的技術(shù)[5]。實驗過程中CI值與細胞數(shù)量呈正比，細胞量越多，CI值越高。首先16×E-plate中各孔分別加入50 μL培養(yǎng)液，進行基線的檢測。然后將稀釋的細胞懸液(每孔8000個細胞)加入到16×E-plate板孔中，實時監(jiān)測細胞的生長狀況。待細胞CI值增加至0.8～1.2時，按上述空白對照組、單純紫外照射組和ZnCl2實驗組的處理方法進行處理。實時監(jiān)測HLEC B-3細胞在16×E-plate板孔內(nèi)的生長狀況。

1.2.2DAPI染色將經(jīng)ZnCl2和UVB處理的空白對照組、單純紫外照射組和ZnCl2實驗組的HLEC B-3細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗去上層懸浮細胞，用40 g·L-1多聚甲醛室溫固定15 min，PBS室溫漂洗3次，每次10 min。加入DAPI避光染色20 min，用PBS室溫漂洗3次，每次10 min。加入PBS在熒光顯微鏡下觀察，用UV波段激發(fā)，觀察拍照。

1.2.3實時熒光定量PCR

1.2.3.1總RNA的提取將HLEC B-3細胞按每孔150×103個接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。經(jīng)ZnCl2和 UVB處理后，繼續(xù)培養(yǎng)2 h消化收集HLEC B-3細胞。各組分別加入1 mL Tripure，再加入200 μL氯仿，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。取上層水相置于新的離心管中，加500 μL異丙醇振蕩混勻， 4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄去上層清液，再加入1 mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇振蕩混勻，4 ℃ 8 000 r·min-1離心5 min。棄去上層清液，所得沉淀即為總mRNA。將沉淀室溫下干燥7 min后用20 μL無RNA酶的DEPC水溶解。取少量總mRNA用微量紫外分光光度計測定mRNA的純度和濃度，其余-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2cDNA的逆轉(zhuǎn)錄取600 ng總RNA，加入Oligo(dT)18 1 μL， DEPC水加至12 μL，然后依次加入dNTP混合物(10 mmol·L-1)2 μL，5 × RT Buffer 4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶RevertAidTM1 μL，使反應(yīng)終體積為20 μL。 42 ℃孵育50 min，然后置于70 ℃ 15 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3RT-PCR擴增以cDNA為模板進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，引物的序列如下：caspase-12上游引物：5’-GGTCGGCTCTTGCAAGGTAACAT-3’；下游引物：5’-TGGGTCAGTATATTTGGGGTCTCA-3’。GAPDH上游引物：5’-GACCACAGTCCATGACATCACT-3’；下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。 DNA模板1.0 μL，2 × SYBR qPCR混合物10 μL，上下游引物各1 μL，DEPC水7 μL。反應(yīng)總體積為20 μL。擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)周期。

1.2.4ELISA檢測Caspase-12蛋白表達的變化將對數(shù)生長期的HLEC B-3細胞按每孔150×103個接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，給予ZnCl2和UVB處理后繼續(xù)培養(yǎng)6 h。消化收集細胞，預(yù)冷的PBS洗滌2遍，超聲波細胞粉碎機粉碎細胞，4 ℃ 8000 r·min-1離心5 min，收集上清，按人Caspase-12 ELISA試劑盒說明書進行操作。用酶標(biāo)儀測量各樣品孔的OD值，計算樣品中Caspase-12蛋白的濃度。

2 結(jié)果

2.1ZnCl2對UVB照射后HLECB-3細胞活性的影響

2.1.1各組細胞生存率與空白對照組(100%)相比，單純紫外照射組HLEC B-3細胞的生存率明顯降低(P<0.01)；而ZnCl2預(yù)處理后再照射UVB的細胞生存率明顯高于單純紫外照射組(P<0.01；見表1)。單純紫外照射組和ZnCl2實驗組不同時間點的細胞生存率比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=16.367，P=0.000；F濃度=142.162，P=0.001；F交互=11.715，P=0.000)。從表1可以看出：3 mg·L-1ZnCl2對UVB照射后HLEC B-3細胞的保護作用最強。

2.1.2RT-CES動態(tài)檢測各組細胞生存率RT-CES顯示出與MTT一致的實驗結(jié)果：與空白對照組相比，單純紫外照射組HLEC B-3細胞的生存率明顯降低，而ZnCl2實驗組細胞生存率明顯高于單純紫外照射組，且以3 mg·L-1ZnCl2實驗組的細胞生存率最高(圖1)。

表1 各組HLEC B-3細胞生存率比較Table 1 Survival rate of HLEC B-3 in each group(±s，n=3，rate/%)

Figure 1 Survival rate of HLEC B-3 in each group dynamic detected by RT-CES RT-CES法動態(tài)檢測各組細胞生存率

2.2DAPI法檢測細胞凋亡壞死空白對照組HLEC B-3細胞核形態(tài)如圖2A所示。與空白對照組相比，ZnCl2實驗組正常細胞核型的細胞數(shù)量減少，并開始出現(xiàn)核邊集、核固縮、核碎裂和凋亡小體(圖2B、C、D)。而單純紫外照射組HLEC B-3細胞的核邊集、核固縮、核碎裂和凋亡小體等細胞凋亡壞死表現(xiàn)更為明顯(圖2E)。

2.3ZnCl2對UVB照射HLECB-3中caspase-12表達的影響實時熒光定量PCR的實驗結(jié)果見圖3。與空白對照組相比，單純紫外照射組HLEC B-3中caspase-12 mRNA 表達水平增高(94.96±30.15)倍。經(jīng)ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)預(yù)處理2 h后再經(jīng)UVB照射的ZnCl2實驗組HLEC B-3細胞caspase-12 mRNA表達較單純紫外照射組明顯下調(diào)，分別為空白對照組的(6.94±4.49)倍、(3.03±1.45)倍、(8.63±4.01)倍，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004、0.002、0.005)。

ELISA法檢測經(jīng)不同濃度ZnCl2和UVB處理后HLEC B-3中Caspase-12蛋白水平：空白對照組細胞中Caspase-12蛋白為(268.31±35.38)pmol·g-1，單純紫外照射組Caspase-12蛋白表達水平上調(diào)，為(1311.98±451.54)pmol·g-1，而經(jīng)ZnCl2(2 mg·L-1、3 mg·L-1、4 mg·L-1)預(yù)處理的實驗組HLEC B-3中Caspase-12的蛋白水平分別為(297.36±20.73)pmol·g-1、(320.25±86.05)pmol·g-1和(412.07±211.33)pmol·g-1；與單純紫外照射組相比，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P=0.000)，但與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 2 HLEC B-3 stained by DAPI (×200，bar=20 μm).A:Blank control group;B:2 mg·L-1 ZnCl2 +UVB group;C:3 mg·L-1 ZnCl2 +UVB group;D:4 mg·L-1 ZnCl2 +UVB group;E:UVB group DAPI染色的HLEC B-3細胞(×200，Bar=20 μm)。A：空白對照組；B：2 mg·L-1 ZnCl2+UVB實驗組；C：3 mg·L-1 ZnCl2+UVB實驗組；D：4 mg·L-1 ZnCl2+UVB實驗組；E：單純紫外照射組

Figure 3 Caspase-12 mRNA expression in HLEC B-3 detected by RT-PCR(**P<0.01 vs.normal group;##P<0.01 vs.UVB group) RT-PCR檢測HLEC B-3細胞中caspase-12 mRNA的表達結(jié)果(與空白對照組相比，**P<0.01；與單純紫外照射組相比，##P<0.01)

3 討論

白內(nèi)障為世界上首要的致盲性眼病，約占致盲眼病的48%[6]，其患病率隨年齡增長而明顯提高。目前主要以手術(shù)方式治療白內(nèi)障。隨著白內(nèi)障手術(shù)技術(shù)的提高和手術(shù)方式的改善，白內(nèi)障手術(shù)的安全性、有效性和可預(yù)測性已經(jīng)得到了極大的提高。但白內(nèi)障手術(shù)治療費用較高，同時手術(shù)治療仍伴隨著不可避免的術(shù)中和術(shù)后并發(fā)癥。因此以非手術(shù)的方式預(yù)防和治療白內(nèi)障仍是眼科研究的重點問題。大量的研究證實UVB輻射與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)[7]。而UVB誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞的凋亡是人和動物白內(nèi)障形成的一個共同細胞學(xué)基礎(chǔ)[8]。鋅是人體非常重要的金屬元素，研究表明鋅缺乏可以誘導(dǎo)細胞凋亡，而補充鋅可以抑制細胞凋亡[9-10]。Duprez等[11]研究表明 ZnCl2可以減少高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，減少大鼠β-細胞的凋亡。UVB照射可誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，進而導(dǎo)致細胞膜、線粒體、基因等正常細胞結(jié)構(gòu)的破壞，最后導(dǎo)致細胞凋亡[12]。因此UVB誘導(dǎo)的細胞損傷本質(zhì)上也是一種氧化應(yīng)激。本研究探討了ZnCl2對UVB照射后的HLEC B-3細胞的作用和其相關(guān)機制。DAPI的研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的ZnCl2可以減少UVB照射誘發(fā)的HLEC B-3的細胞核邊集、核碎裂的發(fā)生，減少凋亡小體的產(chǎn)生。同時MTT和RT-CES的結(jié)果也表明，ZnCl2可以減少UVB誘導(dǎo)的HLEC B-3細胞凋亡，對HLEC B-3起到保護作用。

Caspase家族為常見的死亡因子，可參與多種細胞凋亡的調(diào)控[13-15]。Park等[16]研究表明UVB照射可以上調(diào)caspase-9表達，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑，進而導(dǎo)致細胞的凋亡。caspase-12為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑重要的凋亡因子，caspase-12的表達上調(diào)可以進一步活化caspase-9的表達，進而活化caspase-3，激活caspase依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路。同時caspase-12的表達上調(diào)還可以影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的非正確折疊蛋白質(zhì)的積累，從而促進細胞凋亡。本研究RT-PCR和ELISA的研究結(jié)果表明，UVB照射可以使HLEC B-3中caspase-12 mRNA和蛋白表達均明顯上調(diào)，而ZnCl2預(yù)處理可以明顯抑制UVB照射引發(fā)的caspase-12的表達上調(diào)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路，進而減少HLEC B-3的凋亡。

本研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的ZnCl2對UVB照射后的體外培養(yǎng)HLEC B-3有保護作用，其作用機制可能與ZnCl2抑制UVB照射HLEC B-3中caspase-12上調(diào)表達、減少細胞核邊集、碎裂和凋亡小體的產(chǎn)生有關(guān)，但其詳細機制仍需今后進一步探索。

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date：Jan 17，2014

National Natural Science Foundation of China(No： 81072961);Natural Science Foundation of Shandong Province(No：ZR2010HM032)From theShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine(DU Yu-Xiang，TANG Kai，SI Jun-Kang，SHA Fang)，Jinan250014，ShandongProvince，China；EyeInstituteofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，KeyLaboratoryofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineforPreventionandTherapyofOcularDiseasesinUniversitiesofShandong(GUO Da-Dong，BI Hong-Sheng)，Jinan250002，ShandongProvince，China

Protective effects of zinc chloride with appropriate concentrations on human lens epithelial cell damages induced by UVB irradiation

DU Yu-Xiang，GUO Da-Dong，TANG Kai，SI Jun-Kang，SHA Fang，BI Hong-Sheng

zinc ion;lens epithelial cell;ultraviolet B;caspase-12

Objective To investigate the protective effects and its mechanism of zinc chloride (ZnCl2) with appropriate concentrations on human lens epithelial cells (HLEC) B-3 damage induced by ultraviolet B (UVB) irradiations.Methods HLEC B-3 were incubated with ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1)，then cells were exposed to UVB and the survival rate of control group，UVB group and ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1) +UVB groups were detected by MTT assay;The effects of ZnCl2on UVB-induced HLEC B-3 proliferation was dynamic detected using real-time cell electronic sensing (RT-CES) system;Meanwhile，4’，6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining was performed to monitor the protective effects of ZnCl2on UVB-induced HLEC B-3 cell nuclei;Further，the effects of ZnCl2on UVB-induced caspase-12 protein and mRNA expression in HLEC B-3 were tested by both real-time quantitative PCR (RT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique.Results MTT assay showed the survival rates of HLEC B-3 in UVB group and ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1) +UVB groups at 24 hours were 34.47%±9.31%，65.91%±12.46%，64.30%±16.24% and 46.36%±6.28%，respectively，which at 48 hours were 8.31%±1.38%，53.82%±11.34%，59.25%±7.58% and 36.57%±8.41%，respectively，which at 72 hours were 6.75%±3.71%，48.29%±10.06%，56.53%±8.47% and 39.57%±8.93%，respectively.RT-CES results suggested that ZnCl2(2 mg·L-1，3 mg·L-1，4 mg·L-1) could decrease UVB-induced HLEC B-3 apoptosis and necrosis.DAPI results showed that ZnCl2could decrease UVB-induced HLEC B-3 cell nuclear condensation and nuclear fragmentation.In the meantime，the expression levels of caspase-12 mRNA and protein were inhibited by ZnCl2in HLEC B-3 under UVB irradiation.Conclusion Appropriate concentrations of ZnCl2can efficiently decrease the expression of caspase-12 under UVB radiation and reduce the UVB-induced impairment on HLEC B-3.ZnCl2plays a protective role in HLEC B-3 under UVB irradiation.

杜宇翔，女，1991年6月出生，山東濟寧人，在讀碩士研究生。研究方向：白內(nèi)障及屈光不正。 聯(lián)系電話：15154142299； E-mail:dyx622@163.com

AboutDUYu-Xiang:Female，born in June，1991.Postgraduate student.Tel:15154142299;E-mail:dyx622@163.com

2014-01-17

國家自然科學(xué)基金資助(編號：81072961)；山東省自然科學(xué)基金資助(編號：ZR2010HM032)

250014 山東省濟南市，山東中醫(yī)藥大學(xué)(杜宇翔，唐凱，司俊康，沙芳)；250002 山東省濟南市，山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所、山東省高校中西醫(yī)結(jié)合眼病防治技術(shù)重點實驗室(郭大東，畢宏生)

畢宏生，E-mail:bhs201307@163.com

杜宇翔,郭大東,唐凱,司俊康,沙芳,畢宏生.氯化鋅對紫外線損傷的人晶狀體上皮細胞的保護作用[J].眼科新進展,2014,34(5):405-409.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0112

修回日期：2014-02-20

本文編輯：方紅玲

Accepteddate:Feb 20，2014

Responsibleauthor:BI Hong-Sheng，E-mail:bhs201307@163.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(5)：405-409]