李志華，宋曉凱，趙艷敏，劉岱琳，*

（1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)，江蘇徐州221116；2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津300162）

蘋果中的營(yíng)養(yǎng)功能因子主要為多酚和三萜類成分[1]。近年來(lái)對(duì)于蘋果中的多酚類成分的分離及其抗氧化、心腦血管的保護(hù)作用等多種功效研究較為深入[2-3]，而蘋果中的三萜類成分研究相對(duì)較少。目前在蘋果中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的三萜類化合物有熊果酸，齊墩果酸，薔薇酸，馬斯里酸，科羅索酸等，而熊果酸為蘋果中總?cè)频闹饕煞諿4-6]。蘋果中的總?cè)朴锌拱?、抗菌、抗病毒和抗炎等功能[7-9]，目前未見對(duì)蘋果中總?cè)祁惓煞值暮糠治鲅芯?。為了全面評(píng)價(jià)蘋果中的營(yíng)養(yǎng)成分，比較蘋果不同部位中三萜類成分的分布，本文采用紫外-可見分光光度法，對(duì)不同品種蘋果果皮、果肉中總?cè)频暮窟M(jìn)行了研究。研究結(jié)果為蘋果中總?cè)茽I(yíng)養(yǎng)成分的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

國(guó)產(chǎn)青蘋果、進(jìn)口青蘋果、黃元帥蘋果、紅蛇蘋果、青蛇蘋果、嘎啦蘋果、棲霞蘋果、姬娜蘋果、花牛蘋果、沂蒙山蘋果、紅富士蘋果、西域皇妃蘋果均為市售產(chǎn)品。

1.2 試劑與儀器

熊果酸對(duì)照品、香草醛、無(wú)水乙醇、冰乙酸、高氯酸均為分析純；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；ModulyoD凍干機(jī)：賽默飛世爾；FA1204B電子天平：上海精科；HH-2數(shù)字顯示恒溫水浴鍋：常州市國(guó)華儀器有限公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的熊果酸，置于25 mL棕色容量瓶中，加95%乙醇定容，得0.105 mg/mL的熊果酸對(duì)照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

將蘋果洗凈、剝皮（厚約1 mm～2 mm），果肉切片，之后快速稱量果肉、果皮的重量（鮮果重），在切片程中為防止酶促褐變將蘋果浸泡在3%檸檬酸溶液中，經(jīng)冷凍干燥后分別稱重（干果重），后用粉碎機(jī)粉碎至100目，真空包裝，放于0℃～4℃冰箱中備用。分別稱取不同品種蘋果果皮、果肉干粉5 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL 95%乙醇加熱回流提取2 h，冷卻至室溫后用95%乙醇定容至100 mL，搖勻后精確移取10 mL溶液于100 mL容量瓶中，定容即得樣品溶液。

1.3.3 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取熊果酸對(duì)照品溶液0.6 mL和紅富士蘋果果肉樣品溶液0.2 mL，置于具塞試管中，水浴上蒸干后加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60℃水浴加熱15min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后用分光光度計(jì)在400 nm～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定其最大檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.4 顯色條件的選擇

5%香草醛-冰乙酸溶液用量的選擇：取熊果酸對(duì)照品溶液0.6 mL 6份，水浴蒸干后分別加5%香草醛-冰乙酸溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，后各加高氯酸1.0 mL，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以確定5%香草醛-冰乙酸的最佳用量。

高氯酸用量的選擇：取熊果酸對(duì)照品液0.6 mL 6份，水浴蒸干后分別加5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL，再分別加高氯酸 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以確定高氯酸的最佳用量。

水浴溫度的選擇：取熊果酸對(duì)照品溶液0.6 mL 6份，水浴蒸干后加5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL、高氯酸 1.0 mL，分別在 40、50、60、70、80、90 ℃水浴中反應(yīng)15 min，后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以確定最佳水浴溫度。

水浴時(shí)間的選擇：取熊果酸對(duì)照品液0.6 mL6份，水浴蒸干后加5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL、高氯酸1.0mL，于 60℃水浴中分別加熱 5、10、15、20、25、30min，冰水浴中冷卻后加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以確定最佳水浴時(shí)間。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置于具塞試管中，水浴蒸干后分別加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后用分光光度計(jì)在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度，以熊果酸量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 總?cè)坪康臏y(cè)定

分別吸取上述制備的不同品種蘋果的總?cè)圃嚇尤芤?.2 mL，置于具塞試管中，水浴蒸干后加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后用分光光度計(jì)在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度[10]。根據(jù)測(cè)得的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中的總?cè)坪浚ㄒ孕芄嵊?jì)）。

1.3.7 分析方法的評(píng)價(jià)

精密度實(shí)驗(yàn)：精密量取紅富士果肉樣品溶液5份，每份0.2 mL，按照優(yōu)化條件顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)價(jià)該方法的精密度。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取紅富士果肉樣品溶液0.2mL，按照優(yōu)化條件，顯色后分別在0～60 min內(nèi)測(cè)定其吸光度，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)價(jià)該試驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：稱取相同質(zhì)量的紅富士果肉干粉5份，按1.3.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別取樣品溶液0.2 mL，按1.3.6項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)價(jià)該方法的重現(xiàn)性。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)：在蘋果三萜的樣品液中分別加入不同量的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算總?cè)频暮浚⒂?jì)算其回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

按照1.3.3的方法對(duì)熊果酸對(duì)照品溶液與紅富士蘋果樣品液在400 nm～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 熊果酸對(duì)照品溶液顯色后全波長(zhǎng)掃描譜Fig.1 The wavelength scanogram of ursolic acid after colorable reaction

圖2 紅富士蘋果樣品液加顯色劑顯色后全波長(zhǎng)掃描譜Fig.2 The wavelength scanogram of fuji apple sample after colorable reaction

由圖可見，熊果酸對(duì)照品溶液和樣品溶液，經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)后，最大吸收峰均在550 nm左右，因此以550 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 顯色條件的選擇

按照1.3.4的方法對(duì)5%香草醛-冰乙酸用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，隨著香草醛-冰乙酸溶液的增加，吸光度增大，增加到0.3 mL后吸光度開始減小，故選擇0.3 mL作為最佳用量。

對(duì)高氯酸用量的優(yōu)化結(jié)果表明，隨著高氯酸用量的增加，吸光度先升高后略有下降，當(dāng)加入量為1.0 mL時(shí)吸光度最大，故選擇1.0 mL作為最佳用量。

對(duì)水浴溫度的優(yōu)化結(jié)果表明，隨著溫度升高，吸光度相應(yīng)增大；但水浴溫度超過(guò)60℃時(shí)，空白液開始變色，故選擇水浴溫度為60℃。

對(duì)水浴時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果表明，隨水浴時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度增大，15 min以后吸光度基本不變，故選擇水浴反應(yīng)時(shí)間為15 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以熊果酸量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果圖3所示。

圖3 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of ursolic acid

由圖3可知，熊果酸線性回歸方程為：y=0.007x-0.035（R2=0.999 3），R2=0.999 3，結(jié)果表明熊果酸量在21 mg～126 mg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.4 分析方法的評(píng)價(jià)

精密量度實(shí)驗(yàn)：對(duì)紅富士果肉樣品5份溶液顯色后進(jìn)行吸光度測(cè)定，結(jié)果其吸光度值的RSD為0.87%，表明該測(cè)定方法具有良好的精密度，達(dá)到了樣品分析要求。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對(duì)紅富士果肉樣品溶液顯色后分別在0～60 min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示在15 min～40 min內(nèi)吸光度值穩(wěn)定，RSD為1.13%和1.76%；表明該方法在顯色后15 min～40 min內(nèi)完成較為適宜。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：對(duì)5份由紅富士果肉制備的樣品溶液顯色后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總?cè)频暮?，其含量的RSD為1.23%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)見表1。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Average recovery for ursolic acid in sample spiked and the RSD

由表1可知，5次加標(biāo)回收試驗(yàn)的最低回收率為97.4%，最高回收率為103.78%，平均回收率為100.32%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.99%。表明該方法準(zhǔn)確可靠，此法可用來(lái)對(duì)蘋果樣品溶液進(jìn)行總?cè)坪繖z測(cè)。

2.5 樣品測(cè)定

取不同品種蘋果制備的樣品溶液，按1.3.5項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，每份試樣溶液平行測(cè)定3次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線和凍干蘋果質(zhì)量，計(jì)算凍干蘋果果皮和果肉中總?cè)频暮浚ㄒ孕芄嵊?jì)，mg/g），結(jié)果見表2。

表2 不同品種蘋果中總?cè)坪縏able 2 Total triterpenoids contents of diferent apple varieties

2.6 新鮮蘋果果皮和果肉中總?cè)频暮?/h3>

由凍干蘋果中的總?cè)坪颗c凍干蘋果和新鮮蘋果的質(zhì)量比，即可求得新鮮蘋果中總?cè)频暮?，結(jié)果見表3（Df：凍干果肉占新鮮果肉的比重；Ds：凍干果皮占新鮮果皮的比重）。

表3 不同蘋果品種鮮果中總?cè)坪縏able 3 Total triterpenoids contents of diferent apple varieties in fresh apple

3 結(jié)論

1）采用分光光度法，以熊果酸為對(duì)照品，5%香草醛-冰醋酸-高氯酸為顯色反應(yīng)體系測(cè)定不同品種蘋果中總?cè)频暮俊Ｔ?%香草醛-冰醋酸用量0.3 mL、高氯酸1 mL、60℃反應(yīng)時(shí)間15 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm的條件下，熊果酸量在21 mg～126 mg范圍內(nèi)與吸光度存在較好的線性關(guān)系。

按照優(yōu)化的顯色條件測(cè)得加樣回收平均回收率為100.32%（RSD為2.99%）。該總?cè)坪康臋z測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、精密度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于蘋果中總?cè)坪康臏y(cè)定。

2）測(cè)定結(jié)果顯示同種蘋果的果肉和果皮其總?cè)频暮坎町愝^大，不同品種蘋果果皮和果肉中的總?cè)坪恳泊嬖陲@著差異。蘋果果皮中總?cè)坪扛哂诠庵锌側(cè)频暮?，本課題組前期測(cè)定了不同品種蘋果中多酚的含量[11]，其研究結(jié)果也說(shuō)明蘋果果皮中多酚物質(zhì)含量較高。這些研究結(jié)果都充分說(shuō)明對(duì)于蘋果，盡管果皮量小，但是其所含功能營(yíng)養(yǎng)成分卻不容忽視。

3）不同品種蘋果果皮的總?cè)坪繛?3.2 mg/g～23.9mg/g，蘋果果肉的總?cè)坪繛?.0mg/g～15.0mg/g。不同品種蘋果中總?cè)坪坎町愝^為明顯，其中以紅蛇果皮中總?cè)坪孔罡?，而黃元帥、紅富士和國(guó)產(chǎn)青蘋果果皮中含量較低；蘋果果肉中總?cè)频暮恳愿吕沧罡撸S元帥最低。從原料的資源和可獲得性等角度綜合分析，嘎啦蘋果可以作為總?cè)祁惞δ苄誀I(yíng)養(yǎng)成分開發(fā)利用的優(yōu)選品種。

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