崔 迪，邱守濤，王海燕，賀 杰，漆正堂，孫 易，丁樹哲

耐力運動對營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌細胞自噬及線粒體自噬的影響

崔 迪，邱守濤，王海燕，賀 杰，漆正堂，孫 易，丁樹哲

目的：探討耐力運動對營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌細胞自噬及線粒體自噬的影響及其分子機制。方法：采用6周高脂膳食干預誘導生長期ICR雄性小鼠營養(yǎng)性肥胖模型，建模成功后隨機分為高脂膳食對照組(HC，6只)、普通膳食干預組(HN，6只)及普通膳食聯(lián)合耐力運動干預組(HNE，6只)，另選造模對照ICR小鼠為普通膳食對照組(NC，6只)，HC組小鼠持續(xù)喂養(yǎng)6周高脂膳食，NC、HN、HNE飼以普通膳食，HNE組小鼠進行6周跑臺耐力訓練，速度按周遞增即15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min、35 m/min，40 min/次，6次/周。末次訓練24 h后處死小鼠并采樣，應用JC-1探針法檢測線粒體膜電位，RT-PCR及Western Blotting技術檢測相關基因及蛋白表達情況。結果：1)6周高脂膳食可誘導小鼠體重、LEE’s指數(shù)及附睪脂肪百分比顯著增加(P<0.05)，BG、TG、TC、HDL-C、LDL-C含量顯著增加(P<0.05)；2)與HC比，HNE組骨骼肌MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱc表達均顯著增加(P<0.05)，HN、HNE組MHCⅡb mRNA表達均下調；3)與NC比，HC組骨骼肌線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)，HC、HN、HNE組小鼠骨骼肌mtDNA拷貝數(shù)量下降(P<0.05)；4)與NC組比，HC組小鼠細胞自噬相關信號分子ATG13、LC3 mRNA表達下調，P62 mRNA表達上調；HN、HNE組 BECN1、ATG13及LC3 mRNA含量顯著增加(P<0.05)，HC組LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降，HN、HNE組小鼠骨骼肌p62蛋白水平下降，HNE組LC3Ⅱ/Ⅰ比值上調；5)HC組NIX mRNA表達與NC組比下調，而在HN、HNE組含量增加；HNE組PARK2、PARL mRNA較HN組上調；HC組PINK1蛋白含量有所下調，而在HN及HNE組普遍上調(P<0.05)。結論：1)長期高脂膳食干預可誘導營養(yǎng)性肥胖發(fā)生，引起機體代謝紊亂、骨骼肌線粒體功能異常；2)耐力運動結合膳食改善可有效控制營養(yǎng)性肥胖小鼠體重并促進肌球蛋白的表達；3)耐力運動結合膳食改善可緩解營養(yǎng)性肥胖機體細胞自噬水平的下降，而對線粒體自噬的影響主要通過作用于PINK1/Parkin信號以調控骨骼肌線粒體的數(shù)量和功能。

耐力運動；營養(yǎng)性肥胖；細胞自噬；線粒體自噬；PINK1/Parkin

肥胖發(fā)生伴隨機體代謝紊亂、胰島素抵抗，逐漸成為威脅人類健康的重要因素，現(xiàn)代人尤其我國青少年及兒童高脂、高熱量的飲食習慣是肥胖發(fā)生的主要原因之一。細胞自噬是從真核細胞到哺乳動物高度保守的重要亞細胞事件之一，指細胞在應激情況下可對胞內內容物包裹，并與溶酶體融合降解為生物大分子，重新被細胞利用的過程，目前研究表明，細胞自噬與多種代謝性及退行性疾病發(fā)生密切相關[38]。有研究證實，在外周及中樞組織中運動或熱量限制可激活細胞自噬，是運動促進人類健康的重要分子機制[12,20]，同時，細胞自噬激活劑雷帕霉素的介入可有效阻斷高脂膳食誘導的肥胖發(fā)生[19]。已知，耐力訓練可有效動員脂肪供能及增加骨骼肌胰島素敏感性防治肥胖發(fā)生。那么，在此過程中運動誘導的細胞自噬變化如何尚不得而知[14]。

骨骼肌是平衡機體能量代謝及胰島素敏感性的重要組織，而肌細胞內線粒體是機體能量代謝工廠及信號調控中心之一。線粒體功能正常與否直接影響機體健康，已知神經(jīng)退行性疾病，如帕金森綜合征(Parkinson Disease,以下簡稱PD)、阿爾茲海默病(Alzheimer Disease，以下簡稱AD)及代謝相關疾病，如Ⅱ型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,以下簡稱T2DM)、癌癥等均與線粒體功能障礙密切相關，因此，維持胞內線粒體數(shù)量和功能的相對穩(wěn)定與退行性及代謝性疾病的防治密切相關[9,17,33,41]。線粒體自噬也是典型細胞自噬的一種，從真核生物到高等動物普遍存在，指受損線粒體無法通過自我修復或參與線粒體動態(tài)變化被重新利用，被自噬體包裹后與溶酶體融合而降解的過程，低氧、營養(yǎng)缺乏、Ca2+下降和活性氧(Reactive Oxygen Species,以下簡稱ROS)增多等應激情況均可激活線粒體自噬，線粒體自噬異?？蓪е率軗p線粒體堆積，引發(fā)線粒體功能障礙[48]。高脂膳食誘導的肥胖機體中，伴隨氧化應激異常及線粒體功能障礙，而在此過程中線粒體自噬機制是否參與其中鮮見相關報道[13]。

近年來研究表明，機體運動所觸發(fā)的應激信號尤其是相關激酶信號的激活可有效促進骨骼肌線粒體生物發(fā)生并維持線粒體功能，亦可作用于線粒體自噬促進受損線粒體的清除，但其分子機制仍待進一步研究[1,3,40]。耐力訓練作為防治肥胖的一種干預手段能否通過對細胞自噬和/或線粒體自噬的調控參與代謝性疾病的防控？本研究通過高脂膳食誘導生長期小鼠營養(yǎng)性肥胖模型并對其進行膳食改善及運動干預，探討耐力訓練及高脂膳食對骨骼肌細胞自噬和線粒體自噬的影響，旨為代謝性疾病的運動防治提供理論及數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 建立營養(yǎng)性肥胖小鼠模型

4周齡清潔級ICR(Institute for Cancer Research)雄性小鼠90只，體重34.3±3.41 g，由上海斯萊克動物實驗中心提供。隨機分為普通膳食組(C，12只)及高脂膳食造模組(78只)；根據(jù)肥胖易感模型篩選規(guī)律，6周高脂膳食干預后選取高脂膳食造模組體重增量較大的小鼠為高脂膳食組(H，24只，約1/3)[24,32]。實驗所用飼料由上海市斯萊克動物實驗中心提供，普通膳食及高脂膳食中粗蛋白、脂肪及碳水化合物能量比例分別為17∶14∶48及20∶40∶40；普通飼料含水9.2%、粗蛋白21.1%、粗脂肪5.28%、粗灰粉5.2%、粗纖維4.12%及其他無機鹽與必需氨基酸等；高脂飼料含54.6%普通飼料，另添加豬油16.9%、蔗糖14%、預混料2.1%、酪蛋白10.2%及麥芽糊精2.2%。持續(xù)喂養(yǎng)6周后，從C組和H組分別隨機挑選6只，摘眼球取血后脫臼處死，取附睪脂肪稱重，結合血糖、血脂指標評價造模效果。

1.2 實驗動物分組

營養(yǎng)性肥胖小鼠模型建立成功后，將C組剩余6只作為對普通膳食對照組(NC，6只)，將H組剩余18只隨機分為高脂膳食對照組(HC，6只)、普通膳食干預組(HN，6只)及普通膳食聯(lián)合耐力運動干預組(HNE，6只)。HC組小鼠持續(xù)喂養(yǎng)高脂膳食，NC、HN、HNE飼以普通膳食，HNE組小鼠進行6周跑臺耐力訓練，速度按周遞增即15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min、35 m/min，40 min/次，6次/周，周日休息，跑臺坡度為0%。末次訓練24 h后處死小鼠，取一側腓腸肌冰上勻漿抽提線粒體，其他骨骼肌分置凍存管于液氮中速凍，-80℃超低溫冰箱保存，待測。

1.3 線粒體膜電位測定

線粒體抽提采用Rasmussen實驗室方法進行[37]。以JC-1(四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物)用作檢測線粒體膜電位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)△ψ的熒光探針。按Beyotime C2006說明書推薦比例稀釋JC-1，配制染色工作液，Tecan 2000型酶標儀檢測熒光信號。蛋白定量采用BCA法。

1.4 Real- Time PCR

冰上取腓腸肌約20 mg，按照Beyotime D0063哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒說明書提取DNA，檢測各組線粒體DNA(Mitochondrial DNA,以下簡稱mtDNA)相對含量(mtDNA引物序列：F5′cgataatccccgctctacct3′，R5′agcccatttcttcccatttc 3′)；取腓腸肌約40 mg采用Invitrogen TRIZOL法提取總RNA，使用TOYOBO FSQ101反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA(15℃，5 min；37℃，15 min；85℃，5 min)，ABI StepOne型實時熒光定量PCR儀檢測骨骼肌肌球蛋白相關基因、細胞自噬相關基因及線粒體自噬相關基因相對含量，熒光染料為TOYOBO QPK201 SYBR GREEN(實驗所用引物由上海生物工程有限公司提供合成服務)。

1.5 Western blotting

取骨骼肌約50 mg冰上剪碎入研磨管中，按照Beyotime P0013 Western及IP裂解液說明書加入0.5 mL裂解液(含1 mM PMSF)，OMINI Bead Ruptor 24型磁珠勻漿機勻漿，14 000 g離心15 min，上清轉入離心管，BCA法測定蛋白濃度后蛋白變性。采用10%、12%分離膠電泳，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜；使用5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育12 h，TBST緩沖液清洗后，HRP標記二抗室溫孵育2 h，Millipore ECL超敏試劑盒顯影，AlphaFC2型凝膠成像系統(tǒng)進行冷光掃膜。實驗所用抗體購于Santa Cruz或CST公司，使用FluorChem FC2軟件對所捕捉圖像進行灰度值分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 實驗結果

2.1 高脂膳食誘導營養(yǎng)性肥胖模型的建立

6周膳食干預后，H組小鼠較C組體重、Lee’s指數(shù)及附睪脂肪百分比顯著增加(P<0.05，表1)。

表 1 本研究小鼠體重、Lee’s指數(shù)及附睪脂肪百分比一覽表

注：&&表示與C組比P<0.01；Lee’s指數(shù)=[體重(g)×1 000]1/3/體長(cm)。

與C組比，H組小鼠血糖(Blood Glucose,以下簡稱BG)、甘油三酯(Triglyceride,以下簡稱TG)、總膽固醇(Total Cholesterol,以下簡稱TC)、高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,以下簡稱HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,以下簡稱LDL-C)均顯著增加(P<0.05，表2)。

表 2 本研究血液相關指標一覽表

注：&表示與C組比P<0.05，&&表示與C組比P<0.01。

綜上，6周高脂膳食喂養(yǎng)后H組小鼠形態(tài)學變化表現(xiàn)為體重、Lee’s指數(shù)及附睪脂肪百分比顯著高于C組，且體重增長超過C組小鼠20%；血液相關指標表現(xiàn)為BG、TG、TC、HDL-C、LDL-C含量顯著增加，提示高脂膳食誘導的營養(yǎng)性肥胖小鼠模型建立成功[5]。

2.2 耐力運動及膳食改善對營養(yǎng)性肥胖小鼠體重的影響

營養(yǎng)性肥胖小鼠在耐力運動及膳食干預開始前2周，HN、HNE組小鼠體重增幅逐漸下降，從第3周開始運動結合膳食改善對HNE組小鼠體重控制顯著優(yōu)于HN組(P<0.05，圖1)。

2.3 骨骼肌肌球蛋白重鏈mRNA表達

本研究監(jiān)測了小鼠骨骼肌肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc 4種類型mRNA表達，結果顯示HC組與NC組在肌球蛋白重鏈各分型的轉錄水平無差異，而HNE組在耐力訓練及膳食改善后表現(xiàn)為骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱa、Ⅱc表達均顯著增加(P<0.05)，而HN、HNE組MHC Ⅱb mRNA表達均下調，這可能由于MHCⅡb負責快速力量素質，而本研究采用的跑臺訓練方式主要發(fā)展耐力素質(圖2)。

注：&表示與NC組比P<0.05，&&表示與NC組比P<0.01；##表示與HC組比P<0.01；@表示與HN組比P<0.05，@@表示與HN組比P<0.01。

2.4 骨骼肌線粒體膜電位及mtDNA

HC組小鼠線粒體膜電位較NC組顯著降低(P<0.05)，而在HN及HNE組小鼠骨骼肌線粒體膜電位有所回升；mtDNA相對含量結果顯示，與NC組比，HC、HN、HNE各組小鼠骨骼肌mtDNA拷貝數(shù)量均下降(P<0.05，圖3)。結果提示，高脂膳食誘發(fā)的營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌中線粒體功能及線粒體含量普遍下降，而6周耐力運動和膳食改善在一定程度上改善了線粒體膜電位的下降，但不足以逆轉mtDNA含量的下降。

2.5 骨骼肌細胞自噬相關基因表達

與NC組比，HC組小鼠細胞自噬相關信號分子ATG13、LC3 mRNA表達下調，P62 mRNA表達顯著上調(P<0.01)；HN、HNE組小鼠骨骼肌細胞自噬分子BECN1、ATG13及LC3 mRNA較HC組含量增加(P<0.05)，而調控自噬起始的信號分子ULK1 mRNA表達無變化，參與降解過程的分子P62 mRNA相對含量顯著降低(圖4)。Western Blotting數(shù)據(jù)顯示，反映細胞自噬活性的重要指標LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在HC組骨骼肌中比值下降，伴隨P62蛋白含量無變化，HN、HNE組小鼠骨骼肌P62蛋白水平下降，HNE組LC3Ⅱ/Ⅰ比值上調，提示耐力訓練聯(lián)合飲食改善可有效緩解營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌自噬水平的異常。

圖 3 本研究小鼠骨骼肌線粒體膜電位及mtDNA相對含量變化示意圖

圖 4 本研究小鼠骨骼肌自噬相關基因mRNA及蛋白表達示意圖

2.6 骨骼肌線粒體自噬相關基因表達

HC組小鼠骨骼肌線粒體自噬信號PINK1、NIX mRNA表達與NC組比下調，而在HN、HNE組含量增加；HNE組小鼠線粒體自噬信號PARK2、PARL mRNA較HN組上調；PINK1蛋白含量在HC組有所下調，而在HN及HNE組普遍上調(P<0.05，圖5)。結果提示，在營養(yǎng)性肥胖模型小鼠骨骼肌中線粒體自噬相關的PINK1/Parkin、NIX/BNIP3信號在轉錄及翻譯水平均存在不同情況的異常，而飲食改善結合耐力訓練干預可改善線粒體自噬水平，并且PINK1/Parkin信號相對于NIX/BNIP3信號的變化在骨骼肌中更加敏感。

圖 5 本研究小鼠骨骼肌線粒體自噬相關基因mRNA及蛋白表達示意圖

注：&表示與NC組比P<0.05，&&表示與NC組比P<0.01；#表示與HC組比P<0.05，##表示與HC組比P<0.01；@表示與HN組比P<0.05，@@表示與HN組比P<0.01。

3 分析與討論

3.1 高脂膳食誘導營養(yǎng)性肥胖小鼠模型

肥胖是多種代謝綜合征的表現(xiàn)形式，是T2DM、高血壓、冠心病等疾病的誘因，然而引發(fā)機體肥胖的因素錯綜復雜，包括遺傳、飲食習慣、生活方式、環(huán)境等。為探究能量過剩誘導的營養(yǎng)性肥胖及運動干預對骨骼肌細胞自噬及線粒體自噬相關信號的影響，本研究利用高脂膳食建立小鼠肥胖模型并對其進行運動干預。由于實驗動物存在肥胖易感性差異，因此，在營養(yǎng)性肥胖造模過程中本研究篩選了高脂膳食組體重增量較大的1/3作為研究對象，這在國內外營養(yǎng)性肥胖的研究中均有報道[24,39]。6周高脂膳食干預后，H組小鼠體重增長超過C組20%，血糖及血脂指標均顯著增加，這與相關文獻報道一致，提示營養(yǎng)性肥胖小鼠建模成功[5]。

3.2 耐力訓練對營養(yǎng)性肥胖小鼠細胞自噬的影響

細胞自噬發(fā)生過程可分為自噬體成核、延伸、形成及降解等4個不同的階段[15,16,30,46]。Atg1(Autophagy related gene 1)是酵母細胞自噬的起始因子，其哺乳動物同源基因為ULK1(Uncoordinated-51-Like Kinase 1)。自噬起始ULK復合體由ULK1/2、Atg13、Atg101及FIP200(Focal adhesion kinase family Interacting Protein of 200 kDa)組成[6,11]。正常生理條件下，雷帕霉素靶蛋白(mamalian Target of Rapamycin,以下簡稱mTOR)可使ULK1/2、Atg13磷酸化沉默從而抑制自噬啟動，而當生長因子下降、營養(yǎng)缺乏時，引起相應胞漿Ca2+上調、組織缺氧、ATP合成下降，mTOR活性被抑制并解除了其對ULK1復合體的磷酸化水平，激活的ULK1復合體可磷酸化PIK3C3復合體(Phosphatidylinositol-3-kinase class Ⅲ Complex,PIK3C3 Complex)，使其從微管動力蛋白中分離并與生物膜相互作用，被認為是自噬體形成的初始信號[46]。自噬體成核及延伸過程以PIK3C3復合體為結構中心展開并通過UVRAG(UV-radiation resistance associated gene)或Atg14L連接生物膜，PIK3C3產(chǎn)生較多PI3P(Phasphatidyl-inositol-3-phsphate)可招募更多相關蛋白向自噬體組裝，完成自噬體膜的延伸[43]。自噬體形成過程中，泛素樣結構的形成至關重要，即Atg12-Atg5結合招募Atg16L形成三聚體后最終形成多聚復合體及LC3-PE(microtubule-associated light chain-3-Phosphatidylethanolamine,LC3-PE或LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ的形成已成為細胞自噬重要標志，目前研究者多利用LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值反映細胞自噬水平[26]。在降解過程中，P62(Protein 62)分子參與連接自噬體膜與靶分子或細胞器并隨自噬體降解而降解[44]。

細胞自噬這一重要的亞細胞事件被發(fā)現(xiàn)以來，人們不斷探索其在代謝性及退行性疾病中的表征，研究運動及熱量限制是否可通過對細胞自噬活性的調節(jié)促進人類健康。Wohlgemuth等研究發(fā)現(xiàn)雄性Fischer大鼠骨骼肌LC3及LAMP2(Lysosome-associated membrane protein 2) mRNA及蛋白表達均出現(xiàn)增齡性下降，而自主運動結合熱量限制可上調LC3與LAMP2的表達保持骨骼肌中一定的自噬活性，促進細胞存活[47]。Grumati等研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠脛骨前肌在一次性跑臺訓練1 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較對照組增加近4倍，表明一次訓練后自噬活性的增加有利于受損細胞內容物的清除以維持細胞穩(wěn)態(tài)[18,34]。Smuder等在研究阿霉素(Doxorubicin,以下簡稱DOX)治療癌癥引起肌萎縮副作用的過程中發(fā)現(xiàn)，耐力訓練可適應性調節(jié)自噬活性，即通過調節(jié)BECN1(Beclin-1)、ATG7/9/12表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，對抗DOX所引起的自噬水平的過度激活，緩解肌萎縮[42]。Jamart等檢測成年男子長跑前、后股外側肌細胞自噬相關基因mRNA表達，結果顯示，ATG4/12及LC3 mRNA的表達較運動前分別增加49%、286%、及103%，BNIP3基因表達增加113%，提示超長耐力訓練可有效增加骨骼肌線粒體自噬水平[25]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，游泳耐力訓練可抑制糖尿病SD大鼠骨骼肌萎縮，表現(xiàn)為LC3Ⅱ含量下降抑制細胞過度自噬[29]。由此，運動對細胞自噬活性的調控取決于機體所處生理狀態(tài)，這也是機體對運動適應的結果。本研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌ULK1、ATG13 mRNA下調，LC3 mRNA及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下調，P62蛋白含量增高，表明營養(yǎng)過剩的前提下骨骼肌自噬水平下調，這可能造成胞內代謝廢物不能及時清除，細胞面臨凋亡或壞死的風險；而耐力運動結合膳食改善可有效增加LC3Ⅱ的含量，使骨骼肌細胞自噬水平得以增加，維持細胞正常生理功能。本研究還檢測了骨骼肌肌球蛋白重鏈的表達，未見肥胖小鼠與對照組間存在差異，提示肥胖動物模型并未發(fā)生骨骼肌萎縮這一并發(fā)癥，而耐力訓練結合膳食干預后MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱc轉錄水平顯著上調，提示本研究所采用的運動干預可靠，與Lee等的研究并不沖突。目前對肥胖機體骨骼肌細胞自噬的報道較少，然而Guo等人的研究證實通過藥物激活細胞自噬可有效抑制肥胖發(fā)生，這與本研究通過耐力訓練激活細胞自噬的研究結果相符[19]。Levinie團隊的研究工作不僅在外周組織中檢測到了運動對自噬的調節(jié)作用，還發(fā)現(xiàn)腦組織中細胞自噬的運動激活，她在Science雜志的專訪中反復強調“運動的良藥概念”，并認為細胞自噬是對運動健康促進作用的最好解釋[12,20,21]。

3.3 耐力訓練對營養(yǎng)性肥胖小鼠線粒體自噬的影響

線粒體是細胞內重要的亞細胞結構之一，是檸檬酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,以下簡稱TCA)及氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,以下簡稱OXPHOS)進行的重要場所，有細胞“能量工廠”之稱[17]。線粒體OXPHOS過程中，ROS作為副產(chǎn)物產(chǎn)生并攻擊蛋白質、核酸、脂質等，引起細胞氧化應激；當過多的ROS產(chǎn)生時，線粒體結構或功能受損，此時異常線粒體則產(chǎn)生更多的ROS，導致過氧化惡性循環(huán)[10]。相應地，真核細胞在應激狀態(tài)下存在一系列的線粒體發(fā)生、修復及清除機制，以維持胞內線粒體數(shù)量和功能的相對穩(wěn)定，即線粒體質量控制(Mitochondrial Quality Control,以下簡稱MQC)，包括線粒體生物發(fā)生(核基因表達、線粒體基因表達與線粒體蛋白輸入機制)、線粒體修復(抗氧化系統(tǒng)、泛素-蛋白酶體途徑、線粒體基因修復等)、線粒體動態(tài)變化(融合與分裂)、細胞自噬和/或線粒體自噬均參與其中[2,10,17]。線粒體自噬從單細胞生物到哺乳動物普遍存在，是細胞自噬的一種，屬于選擇性細胞大自噬，指細胞內受損的線粒體被特異性包裹進入自噬體并與溶酶體融合，從而完成受損線粒體的降解，維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定[2,4,22,48]。

已知運動可調控細胞自噬的水平參與骨骼肌代謝，但線粒體自噬作為選擇性細胞大自噬的一種，其分子機制并非如細胞自噬一樣高度保守。1966年，Duve首次報道了胰高血糖素作用下肝細胞內大量線粒體出現(xiàn)碎片化[8]。隨后在酵母細胞及哺乳動物體內也先后發(fā)現(xiàn)了線粒體自噬，但直到2007年Mitophagy一詞才由Insil Kim創(chuàng)造并用來表示細胞對線粒體選擇性清除這一過程[27]。Atg32參與介導了酵母細胞中線粒體的清除，主要是Atg32與Atg8(與LC3同源)相互作用促進自噬體與線粒體結合；PINK1/Parkin信號參與了真核細胞線粒體自噬分子機制，正常情況下PINK1被線粒體輸入機制(Protein imput machinery,PIM)輸入到線粒體膜間隙，在PARL(Presenilins-associated rhomboid-like protein)分子的作用下降解，而當MMP下降時，PINK1定位到線粒體外膜并招募泛素連接酶Parkin，引起線粒體外膜蛋白的級聯(lián)泛素化，抑制受損線粒體的流動性及其與“健康”線粒體融合的可能，并促進自噬體對其特異性識別并包裹，最終自噬體與溶酶體結合，受損線粒體得以降解[45,48]。另有報道表明，NIX/BNIP3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)信號參與了哺乳動物成熟過程中線粒體的清除過程，且參與線粒體修復及線粒體自噬過程，與MQC機制密切相關[2,48,49]。值得注意的是，參與以上3種經(jīng)典線粒體自噬的分子機制迥異，并不存在同源類似物，而對骨骼肌線粒體自噬的信號目前認為主要是PINK1/Parkin參與介導，而亦有報道稱參與紅細胞形成過程中線粒體自噬的信號分子NIX以及BNIP3通過P53的轉錄靶基因Mieap (Mitochondrial eating protein)參與了線粒體的質量控制，其中，也包括其介導的線粒體自噬途徑[7,35]。因此，本研究著重探討PINK1/Parkin及NIX/BNIP3信號如何調控骨骼肌線粒體自噬，在運動對營養(yǎng)性肥胖模型的干預過程中影響如何。

已知肥胖機體細胞內氧化應激及線粒體生物發(fā)生異常，引發(fā)線粒體功能障礙，但在此過程中對線粒體自噬的影響鮮有報道。由于線粒體自噬屬于機體逆向適應的新領域，目前關于運動與線粒體自噬的研究也相對較少，主要集中于藥物刺激及基因修飾方面。Liu等研究發(fā)現(xiàn)ALCAT1 (A Lysocardiolipin Acyltransferase 1)缺失可上調PINK1的表達，增加線粒體自噬水平，緩解氧化應激，促進線粒體質量控制從而促進心肌細胞存活[31]。Kublin等認為，線粒體自噬是細胞內普遍存在的線粒體自我更新過程，線粒體受損可同時激活線粒體自噬及線粒體依賴的細胞凋亡，當應激程度處在細胞可抵御范圍之內時，線粒體自噬啟動且該過程先于細胞凋亡[28]。P53基因敲除及TIGAR (TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator)基因敲除小鼠心肌ROS含量明顯增加，BNIP3表達上調促進線粒體自噬，而用抗氧化劑NAC (N-acetyl-cysteine)處理后，BNIP3活性適應性下調[23]。O’Leary等研究采用去神經(jīng)手術模擬骨骼肌廢用模型發(fā)現(xiàn)，小鼠骨骼肌質量下降，p62及Parkin向線粒體定位明顯增加，提示骨骼肌廢用引起線粒體受損，線粒體自噬應答機制啟動，而可能后期降解機制受阻介導肌萎縮[36]。以上研究提示，氧化應激可能是線粒體自噬的先決信號，而運動訓練又是引起適度氧化應激的手段，對研究運動、氧化應激及線粒體自噬的相互關系有一定指導意義。本研究結果顯示，高脂膳食誘導的營養(yǎng)性肥胖小鼠模型中，其NIX mRNA有所下降，PINK1/Parkin信號無變化，而在運動干預過程中，PINK1、PARK2、PARL以及NIX、BNIP3 mRNA均適應性增加，而PINK1的蛋白表達水平在耐力運動與膳食改善后較高脂對照組增加約1倍，該結果提示，在運動改善營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌線粒體自噬過程中PINK1/Parkin及NIX/BNIP3信號的轉錄水平都發(fā)生適應性增加，而經(jīng)典的PINK1/Parkin信號所介導的線粒體自噬則發(fā)揮主要作用，然而具體作用機制仍需要進一步研究。

綜上，高脂膳食誘導的營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌線粒體自噬相關基因表達并無顯著變化，提示肥胖機體線粒體功能障礙可能并非由線粒體自噬水平變化引起，而是與線粒體生物發(fā)生或融合、分裂異常有關。有趣的是，耐力訓練引起的機體能量消耗增加促進骨骼肌線粒體自噬信號PINK1基因表達顯著增加，可能是由于運動介導氧化應激是線粒體自噬的先決信號，促進線粒體更新及功能改善。

4 結論

長期高脂膳食干預可誘導營養(yǎng)性肥胖發(fā)生，導致機體代謝紊亂，骨骼肌線粒體功能異常。耐力運動結合膳食改善可有效控制營養(yǎng)性肥胖小鼠體重并促進肌球蛋白的表達。耐力運動結合膳食改善可緩解營養(yǎng)性肥胖機體細胞自噬水平的下降，而對線粒體自噬的影響主要通過作用于PINK1/Parkin信號以調控骨骼肌線粒體數(shù)量和功能。

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TheEffectofEnduranceExerciseonAutophagyandMitophagyintheSkeletalMuscleofMicewithAlimentaryObesity

CUI Di,QIU Shou-tao,WANG Hai-yan,HE Jie,QI Zheng-tang,SUN Yi,DING Shu-zhe

Objective:To determine the effect of endurance exercise on cellular autophagy and mitophagy in skeletal muscle of obese mice and explore the underlying molecular mechanism.Methods:After the alimentary obesity ICR mice modle constrction,the obese mice were randomly divided into high-fat diet control group (HC,n=6),normal diet amelioration group (HN,n=6) and normal diet combined with endurance exercise group (HNE,n=6).The mice of normal diet control group during the constrction of alimentary obesity model were assigned as the normal control group (NC,n=6).The mice in groups NC,HN and HNE were fed with nomal diet while the mice of group HC were fed with high-fat diet .The mice of group HNE underwent treadmill running for 6 weeks,45min/d,6 times per week.Results:1) High-fat dier for 6 week increased the body weight,Lee’s index and epididymal fat percentage of mice,while a series of blood index such as BG,TG,TC,HDL-C and LDL-C increased significantly.2) The relative contents of myosin heavy chain Ⅰ,Ⅱa and Ⅱc mRNA were upregulated in group HNE,compared with group HC.3) The mitochondrial membrance potential of skeletal muscle in group HC was lower than that of group NC,while the mtDNA relative content in group HC,HN and HNE were lower than NC.4) Compared to NC,the autophagy related genes ATG13 and LC3 mRNA decreased while P62 mRNA expression level increased;the BECN1,ATG13 and LC3 mRNA relative content of HN and HNE were higher than those in HC (P<0.05) and the ratio of LC3Ⅱ/Ⅰof HNE increased in skeletal muscle compared with HC.5) The mitophagy related gene NIX mRNA expression was lower in HC compared to that of NC,whereas it accerlarated in group HN and HNE;in group HNE,the PARK2 and PARL mRNA relative content increased compared to HN;the protein content of PINK1down-regulated in HC and up-regulated obviously in group HN and HNE(P<0.05).Conclusion:1) Long-term high-fat-diet intervention can lead to alimentary obesity accompanied with metabolic disorders and mitochondrial dysfunction in the skeletal muscle.2) Endurance exercise combined with dietary intervention can effectively slow down the weight gain and increase the protein expression of myosin heavy chain in the alimentarily obese mice.3) Endurance exercise combined with dietary intervention can obviously attenuate the decline of autophagy level induced by high-fat-diet as well as maintain the quality and function of mitochondria in skeletal muscle,in which the mitophagy related PINK1/Parkin singnaling pathway involves and plays a crititial role.

exercise;alimentaryobesity;autophagy;mitophagy;PINK1/Parkin

1000-677X(2014)12-0063-09

2014-07-14；

：2014-11-10

國家自然科學基金資助項目(31171142)；青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室建設項目(40500-541235-14203/004)。

崔迪(1987-)，女，河南博愛人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動適應與線粒體調控，E-mail：cuidi616@163.com；邱守濤(1986-)，男，山東濟寧人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動對健康作用的分子機制研究；王海燕(1983-)，女，彝族，云南紅河州人，在讀博士研究生，主要研究方向為骨骼肌代謝與運動適應；賀杰(1977-)，女，河南南陽人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動適應與健康；漆正堂(1979-)，男，湖北黃岡人，高級工程師，博士，主要研究方向為線粒體運動適應與信號調控；孫易(1985-)，女，黑龍江哈爾濱人，講師，博士，主要研究方向為運動對肥胖和Ⅱ型糖尿病的干預作用；丁樹哲(1963-)，男，黑龍江哈爾濱人，教授，博士研究生導師，主要研究方向為運動適應與線粒體調控，Tel：(021)62235425，E-mail：szding@ied.ecnu.edu.cn。

華東師范大學 青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室，上海 200241 Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention,Ministry of Education,East China Normal University,Shanghai 200241,China.

G804.7

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