王東 魏文平 王芳

依那普利對壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化的影響及microRNA-214的表達變化

王東 魏文平 王芳

目的 探討壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌纖維化過程中microRNA-214的表達變化，以及依那普利對心肌纖維化的影響。方法 80只雄性SD大鼠隨機分為壓力超負(fù)荷組（Model，n=40），假手術(shù)組（Sham，n=40）。其中各組再隨機分為兩個亞組：依那普利治療組（n=20）與無依那普利治療組（n=20）。行腹主動脈縮窄術(shù)建立心臟壓力超負(fù)荷大鼠模型。4周后，酶聯(lián)免疫分析法測定各組大鼠血清中的PICP、ICTP、MMP-2、TIMP-2等心肌纖維化指標(biāo)，熒光實時定量PCR技術(shù)檢測的microRNA-214表達變化。結(jié)果 壓力超負(fù)荷組大鼠的PICP為(161.3±16.3)ng/L、ICTP為(3.06±0.5)、PICP/ICTP 比值為(51.1±7.3)、MMP-2為(2638.2±289.6)pg/mL、TIMP-2為(4396±365.9)ng/mL，上述指標(biāo)與假手術(shù)相比，均有所增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；模型組MMP-2/TIMP-2比值為(0.6±0.4)，顯著低于假手術(shù)組（P<0.05），依那普利處理亞組的大鼠PICP為(114.1±19.6)ng/L、ICTP為(2.5±0.7)ng/ L、PICP/ICTP比值為(45.1±16.3）、MMP-2為(806.8±301.6)pg/mL、TIMP-2為(2052.6±322.3)，均低于單純壓力超負(fù)荷組，異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。依那普利處理亞組MMP-2/TIMP-2比值為(0.88±0.3)，顯著高于單純壓力超負(fù)荷組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時壓力超負(fù)荷處理會導(dǎo)致microRNA-214的表達相對于假手術(shù)組增高（2.1±0.3）倍，依那普利處理可以緩解壓力超負(fù)荷引起的microRNA-21過表達，但仍為假手術(shù)組的（1.5±0.2）倍。結(jié)論 依那普利可以緩解壓力超負(fù)荷造成的心肌纖維化，microRNA-214與此過程有關(guān)，可作為心肌纖維化的治療靶點或標(biāo)志物。

壓力超負(fù)荷；大鼠；依那普利；心肌纖維化；微小RNA-214

心肌纖維化是指心肌細(xì)胞外的基質(zhì)大量沉積，膠原濃度和膠原容積(collagen volume fraction，CVF)顯著增加，各型膠原代謝、排列紊亂，心肌纖維化影響心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能，如造成心肌肥厚，順應(yīng)性降低，舒縮功能障礙，它是心室重構(gòu)的表現(xiàn)，心房顫動的誘因，最終導(dǎo)致心衰、心律失常[1]。由高血壓等疾病引起心臟壓力超負(fù)荷是心肌纖維化的主要原因，其機制為心臟壓力超負(fù)荷可導(dǎo)致一系列的級聯(lián)信號的瀑布激活，從而誘發(fā)膠原代謝障礙，但是該機制十分復(fù)雜，涉及分子眾多，如能更加明確該機制，可為對抗壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌纖維化提供治療靶點[2]。近年來，除膠原代謝方面的機制得到了大量研究外，一些膠原代謝中的因子可以作為心肌纖維化的明確指標(biāo)，如Ⅰ型前膠原羧基端肽（procollagen type I C-terminal peptide,PICP）、Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)肽（Type I collagen cross-linked telopeptide, ICTP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑(metallopeptidase inhibitor 2,TIMP-2)等[3]。此外，microRNA的研究也成為了研究熱點，有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-214在心肌缺血/缺氧損傷中存在高表達[4]，但其與壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌纖維化是否有關(guān)還未見報道。大量研究已證實血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)類的藥物可以減輕心肌纖維化、減少心室重構(gòu)、改善心力衰竭預(yù)后[5]，本研究旨在結(jié)合上述膠原代謝指標(biāo)，探索依那普利對壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化的影響及microRNA-214在此過程中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 分組和處理方法 80只雄性SD大鼠（購自蘭州大學(xué)動物實驗中心）隨機分為壓力超負(fù)荷組（Model，n=40），假手術(shù)組（Sham，n=40）。其中各組再隨機分為2個亞組：依那普利治療組（n=20）與無依那普利治療組（n=20）。依那普利（江蘇制藥股份有限公司）使用劑量為10mg/(kg·d)，灌胃方式給藥，1次/d。壓力超負(fù)荷組行腹主動脈縮窄術(shù)以建立壓力超負(fù)荷模型。各組干預(yù)4周后處死，檢測各組纖維化指標(biāo)以及microRNA-214的表達變化。

1.2 纖維化指標(biāo)的檢測 大鼠處死后，立即打開胸腔，抽取3mL動脈血。酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測各組大鼠血清中的Ⅰ型前膠原羧基端肽（PICP）與Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)肽（ICTP）的濃度檢并計算PICP/ICTP比值。同時檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑(TIMP-2)濃度。

1.3 檢測各組microRNA-214的表達變化 剪去心臟心室組織，冰上操作快速剪碎。用總RNA提取試劑盒（美國QIAGEN公司）提取組織中的總RNA，使用microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司），按照所說明書構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄體系，將microRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用GO Taq? qPCR Master Mix（普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司）對cDNA進行擴增，體系參照說明書。使用2-△△CT法分析各組的miR-214的相對表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相比假手術(shù)組，壓力超負(fù)荷模型組下大鼠PICP水平增高、ICTP增高、PICP/ICTP比值增高。對于壓力超負(fù)荷模型組來講，依那普利治療亞組血清PICP、PICP/ICTP的比值均顯著降低，與非依那普利的壓力超負(fù)荷模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。假手術(shù)組兩亞組之間的PICP、PICP/ICTP的比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，壓力超負(fù)荷模型組血清MMP-2水平、TIMP-2水平比假手術(shù)組顯著提高(P均<0.05)。對于壓力超負(fù)荷模型組來講，依那普利治療亞組血清MMP-2水平、TIMP-2水平均顯著降低，MMP-2/TIMP-2的比值增高。與非依那普利的壓力超負(fù)荷模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均< 0.05)。假手術(shù)組各亞組的MMP-2水平、TIMP-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表1、表2）。

表1 各組大鼠PICP與ICTP血清水平

表2 各組大鼠MPP-2與TIMP-2血清水平

2.2 相比假手術(shù)組，壓力超負(fù)荷模型組的miR-214表達水平明顯提高，其中依那普利治療亞組的miR-214表達相對于假手術(shù)組的依那普利治療亞組提高了（1.5±0.2）倍，非依那普利治療亞組的miR-214表達相對于假手術(shù)組的非依那普利治療亞組提高了（2.1±0.3）倍。且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。假手術(shù)組中依那普利亞組的miR-214表達水平低于非依那普利亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，見圖1）。

圖1 各組大鼠miR-214的表達變化。注：Sham表示無依那普利治療的假手術(shù)組，Model表示無依那普利治療壓力超負(fù)荷組，Sham+ena表示依那普利治療的假手術(shù)組，Model+ena表示依那普利治療的壓力超負(fù)荷組。與無依那普利治療的假手術(shù)組相比，aP<0.05。與無依那普利治療的壓力超負(fù)荷亞組相比，bP<0.05

3 討論

壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌纖維化是確定的事實，本研究通過構(gòu)建模型，制造壓力超負(fù)荷條件后，檢測各種心肌纖維化指標(biāo)，確實提示有心肌纖維化的發(fā)生。壓力超負(fù)荷可以通過激活多個因子及其涉及的信號通路來誘發(fā)心肌組織膠原代謝紊亂，引起心肌纖維化。這些因子或信號包括：EGR-1的表達、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)信號通路、人體補體因子B的表達、Rho激酶信號通路[5-7]。而這些因子或信號通路都會受到善血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的激活，即血管緊張素Ⅱ的濃度從一定程度上來講會增加心肌的纖維化，而實際上確有研究表明心肌纖維化的過程中存在AngⅡ水平的增高[5]。因而AngⅡ可作為心肌纖維化的指標(biāo)，同時從另一個角度考慮，抑制AngⅡ的水平也許可以減緩心肌的纖維化。依那普利是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可以降低AngⅡ的水平，本研究中，在壓力超負(fù)荷的情況下，纖維化指標(biāo)提示出較為旺盛的膠原代謝，并出現(xiàn)了失衡，即膠原的合成要大于分解，而依那普利的使用一定程度上恢復(fù)了這種失衡，表明其降低了壓力超負(fù)荷造成的心肌纖維化。同時研究中發(fā)現(xiàn)，壓力超負(fù)荷會導(dǎo)致microRNA-214的表達增高，依那普利的使用，在心肌降低纖維化的同時，降低了microRNA-214的表達，這提示microRNA-214除了與缺血/缺氧損傷有關(guān)外，還參與心肌纖維的發(fā)展過程，其次提示microRNA-214與AngⅡ具有一定的聯(lián)系。microRNA-是一種微小RNA，微小RNA是真核生物中廣泛存在的一種長約21～23個核苷酸的單鏈RNA分子，可調(diào)節(jié)多種基因的表達，進而影響細(xì)胞的分化、凋亡等活動[8]，但本研究尚未闡明microRNA-214在心肌纖維化中的具體作用，這需要在進一步的研究中探索?？傊?，本研究證實了，依那普利可以緩解壓力超負(fù)荷造成的心肌纖維化，其機制microRNA-214的表達增高，microRNA-214可作為心肌纖維化的診斷指標(biāo)或者治療靶點，但其與心肌纖維化的關(guān)系需要更深入的研究。

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Objective To investigate the expression of microRNA-214 in the myocardial fibrosis induced by pressure-overloaded treatment and the effect of enalapril in this process. Methods 80 male Spargue Dawley rats randomly was divided two groups: sham-operation group (n=40) and pressure-overloaded group (n=40) ,each group was divided two subgroups: enalapril treatment subgroup (n=20) and without enalapril treatment subgroup (n=20). Using ELISA kits to detect the level of PICP, ICTP, MMP-2 and TIMP-2 in serum, furthermore qrt-PCR was used to analyzed the expression of microRNA-214. Results Compared with the sham group pressure-overloaded treatment can increase the level of PICP, ICTP, PICP/ ICTP ratio, MMP-2 and TIMP-2 significantly[(161.3±16.3) ng/L, (3.06±0.5), (51.1±7.3), (2638.2±289.6 )pg/mL, (4396±365.9)ng/mL, P<0.05], after enalapril treatment the level of PICP, ICTP, PICP/ICTP ratio, MMP-2 and TIMP-2 were decreased[(2.5±0.7)ng/L, (45.1±16.3), (806.8±301.6) pg/mL, (2052.6±322.3),P<0.05]. MPP-2/ TIMP-2 ratio was (0.6±0.4) that is the lowest in pressure-overloaded group , After enalapril treatmen, MPP-2/ TIMP-2 ratio was elevated to (0.88±0.3). Meanwhile pressure-overloaded treatment can induce microRNA-214 overexpression[(2.1±0.3) fold relative to Sham group] and enalapril can decreased the expression of microRNA-214[(1.5±0.2) fold relative to Sham group]. Conclusion Enalapril can relieve the myocardial fibrosis caused by pressure-overloaded treatment and microRNA-214, which may be a target or indicator for therapy of myocardial fibrosis, was involved in this process.

Pressure overload; Rat; Enalapril; Myocardial fibrosis; microRNA-214

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.003

甘肅 730000 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 （王東 王芳） 蘭州石化總醫(yī)院 （魏文平）

王芳 E-mail:wangf_lzu@163.com