花陽景，林碧瑜，張智勇，游佳琪，劉希華

（三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建 三明 365004）

加拿大楊莖段愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化研究

花陽景，林碧瑜，張智勇，游佳琪，劉希華

（三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建 三明 365004）

以加拿大楊莖段為外植體探討不同激素處理對愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽形成的影響。研究表明，在外植體消毒中，以0．1%升汞處理4．5m in時間效果最好，以MS培養(yǎng)基+0．15mg·L-1TDZ+0．1mg·L-1NAA+1．0mg·L-16-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)60%。叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0．15mg·L-1TDZ+0．125mg·L-1NAA+1．25mg·L-16-BA，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)86．7%。

加拿大楊；愈傷組織；不定芽；組織培養(yǎng)

加拿大楊（Populus canadensis Moench）又稱加楊、歐美楊，屬于楊柳科（Salicaceae），是美洲黑楊和歐洲黑楊雜交種。其生長迅速，繁殖容易，適應(yīng)性較強(qiáng)，既可以成片造林，又能做“四旁”栽植，全國各地均有種植，生長快速[1]。木材質(zhì)軟而輕，是優(yōu)良的纖維用材樹種[2]，因其樹冠闊，葉片大而有光澤，宜作行道樹、庭蔭樹、公路樹及防護(hù)林等，又因其孤植、列植均適宜，故是常見的綠化樹種，也是“四旁”綠化和營造農(nóng)田林網(wǎng)的重要樹種之一[1]。近年來，加拿大楊應(yīng)用前景看好，但是由于受到母種材料的短缺，還有繁殖季節(jié)較短的限制，常規(guī)的扦插繁殖已經(jīng)很難滿足生產(chǎn)中對種苗的需求。在全國范圍內(nèi)的退耕還林及退耕還草的形勢下，加拿大楊已經(jīng)呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的趨勢。加拿大楊的組培再生體系的研究卻未見報道。本研究是通過對加拿大楊莖段的愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽的分化研究，目的是解決加拿大楊在生產(chǎn)中種苗不足的問題，加速實現(xiàn)加拿大楊工廠化育苗，完善加拿大楊的組培快繁體系。同時通過愈傷組織的誘導(dǎo)分化研究，為加拿大楊的遺傳改良和遺傳轉(zhuǎn)化等研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自于三明學(xué)院的加拿大楊樹上當(dāng)年生枝條。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理與培養(yǎng)

2012年8月～10月之間，選取三明學(xué)院的加拿大楊當(dāng)年生枝條，于中午時分，采取健康的枝條，從自莖尖開始剪成約2 cm左右的莖段。外植體處理的過程是：洗潔精洗凈，浸泡30 min→0.1%的多菌靈浸泡3 0min→流水沖洗2.0 h→75%酒精處理30 s→0.1%升汞溶液處理→無菌水沖洗5遍。

接種時，將芽以形態(tài)學(xué)下端接入培養(yǎng)基，芽原基接觸培養(yǎng)基。每瓶植入一個芽段。做好標(biāo)記，放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光強(qiáng)2000 lx，光照時間12h·d-1，溫度(25±1)℃。每隔2～3 d觀察一次，清出污染的組培瓶以減少污染，觀察記錄結(jié)果。

1.2.2 升汞處理對外植體誘導(dǎo)的影響

為比較0.1%升汞的處理時間對外植體的影響，采用4種升汞處理時間（2.5，3.5，4.5，5.5min）。每個處理20瓶，3次重復(fù)。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

將莖段接種到以MS為基本培養(yǎng)基，以NAA、6-BA、TDZ 3種不同濃度的激素組合做為探討因素，激素配比采用L9（34）正交試驗設(shè)計，設(shè)計如表1，培養(yǎng)基中含3%的蔗糖、8 g的瓊脂，pH值為6.0。每組處理20瓶，3次重復(fù)，1個月后觀察愈傷組織生長情況并統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

表1 莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)因素與水平表

1.2.4 叢生芽的誘導(dǎo)與分化

以MS為基本培養(yǎng)基，加入0.15 mg·L-1TDZ、3%的蔗糖和8g的瓊脂，pH值為6.0。以雙因素完全隨機(jī)設(shè)計來分析6-BA（0.75、1.25mg·L-1）和NAA（0.075、0.125 mg·L-1）兩種濃度的激素組合對不定芽分化的影響。將大小相近的愈傷組織分別接在4種培養(yǎng)基上，每個處理接種30塊愈傷組織，3次重復(fù)。每隔一個月繼代一次。30 d后觀察愈傷組織和叢生芽生長狀況，統(tǒng)計各處理叢生芽誘導(dǎo)率。

1.3 統(tǒng)計方法與數(shù)據(jù)分析

觀察愈傷組織及叢生芽產(chǎn)生的時間，愈傷組織以及叢生芽生長狀況，形態(tài)以及顏色等。對相關(guān)試驗結(jié)果統(tǒng)計，拍照。統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，叢生芽誘導(dǎo)率。

出愈率（%）=產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)/接種的外植體數(shù)×100

叢生芽誘導(dǎo)分化率（%）=叢生芽分化數(shù)/轉(zhuǎn)接愈傷組織數(shù)×100

芽分化數(shù)=叢生芽個數(shù)/轉(zhuǎn)接愈傷組織數(shù)

采用唐啟義的DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)[3]。

表2 升汞處理時間對出愈率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 升汞消毒處理時間對出愈率的影響

升汞的處理時間對外植體的生長會產(chǎn)生一定的影響，假如處理時間過長，外植體會受到傷害甚至是死亡，處理時間過短則殺菌消毒不徹底，外植體在培養(yǎng)過程中容易染菌。結(jié)果表明，第1（2.5 min）與第2（3.5 min）處理組大部分為細(xì)菌污染，第3（4.5 min）與第4（5.5 min）處理組則多為真菌污染。由表2可以得當(dāng)0.1%升汞的時間超過5.5 min后，無菌率明顯提高，消毒效果明顯，但出愈率則相對最低，說明外植體開始受到升汞的毒害作用。但隨著0.1%升汞處理時間的減少，無菌率也相對降低，這樣出愈率也較低。綜合0.1%升汞的不同處理時間的無菌率和出愈率，發(fā)現(xiàn)第3處理組即0.1%升汞處理4.5 min，無菌率相對較高，達(dá)到70%，出愈率也達(dá)到60%。

升汞處理時間低于3.5 min，外植體所引起的污染多是細(xì)菌所引起的污染，外植體殺菌時間不夠徹底。在4.5 min這段時間內(nèi)，滅菌效果則較好，污染率低，出愈率超過5.5 min，因此0.1%升汞處理時間以4.5 min為最佳。

2.2 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)研究

采用正交試驗來分析不同的激素種類與濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。誘導(dǎo)結(jié)果如表3。

表3 不同激素濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3的統(tǒng)計結(jié)果可以看出，莖段愈傷組織所用的三種植物激素6-BA，NAA，TDZ不同配比的培養(yǎng)基中，莖段愈傷組織最高誘導(dǎo)率可以達(dá)到60.0%。因此，對于莖段外植體的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.15mg·L-1TDZ，長出的愈傷組織如圖1和圖2，大小約為3.30cm2，為嫩綠色，致密狀愈傷組織，在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，調(diào)整激素后，能誘導(dǎo)出不定芽。而第1組即，MS培養(yǎng)基+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA+0.05mg·L-1TDZ，愈傷組織誘導(dǎo)率僅16.7%，而且面積也比較小，大小僅2.53 cm2，且為土黃色，絮狀，在經(jīng)過轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2個月后，愈傷組織逐漸消亡。

表4 方差分析表

對正交試驗的各因素進(jìn)行分析，K代表每個因素試驗結(jié)果的總和，從表3中的K值大小可以看出，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中的各因素最優(yōu)組合是A2B2C3，而這一組合正好在這個正交試驗表中出現(xiàn)，即MS培養(yǎng)基+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.15mg·L-1TDZ。從R值（代表每個因素3個水平的K值的全距）大小可以看出，3個因素對出愈率影響的主次關(guān)系為：C→A→B，各處理的較優(yōu)因子依次為：C3，A2，B2。同時本研究對出愈率進(jìn)行方差分析（表4），僅C因素（TDZ）達(dá)到顯著。

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)

圖2 愈傷組織誘導(dǎo)

2.3 不同激素濃度對叢生芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

由表5可知，對于加拿大楊通過愈傷組織進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，第4處理組的叢生芽誘導(dǎo)率最高，高達(dá)86.7%，且叢生芽長較好（圖4）。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.15mg·L-1TDZ+1.25mg·L-16-BA+0.125mg·L-1NAA。愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基15d后，愈傷組織上長出嫩綠的小芽，愈傷組織整體變得更致密，基部靠近培養(yǎng)基的部分變紅，如圖3。經(jīng)過1個月的培養(yǎng)后，芽開始生長分化，芽生長最高為2.5 cm，如圖4。對雙因素進(jìn)行方差分析（表6），結(jié)果表明，NAA因素達(dá)到顯著差異，而6-BA則不顯著。

表5 激素濃度對叢生芽的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

表6 方差分析表

3 討論

在普通的自然條件下，在8～10月份進(jìn)行外植體取材，其組織培養(yǎng)的污染率低[4]。同時，采取外植體時必須保證前3 d以上的天氣晴朗，避免雨天所帶來的真菌，細(xì)菌污染。本研究通過0.1%升汞不同消毒時間，得出0.1%升汞時間在4.5 min時，無菌率相對較高，達(dá)到70%，出愈率也達(dá)到60%。

以莖段為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)中，最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.15mg·L-1TDZ，長出的愈傷組織大小約為3.30 cm2，為嫩綠色，致密狀愈傷組織，在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，調(diào)整激素后，能誘導(dǎo)分化出不定芽。作為建立再生體系的前提及基礎(chǔ)，愈傷組織的誘導(dǎo)非常關(guān)鍵。其形成一般分為3個階段：誘導(dǎo)期、分裂期和形成期[5]。加拿大楊莖段則采用6-BA、NAA以及TDZ 3種激素搭配誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，NAA能夠誘導(dǎo)莖段脫分化形成愈傷組織，形成綠色致密狀的愈傷組織，加入TDZ可促進(jìn)叢生芽的分化，形成的芽體生長迅速。TDZ是一種新型具有細(xì)胞分裂素活性的一類物質(zhì)，是一種苯基脲衍生物，商品名為塞苯隆。在各種細(xì)胞分裂素類物質(zhì)當(dāng)中，TDZ的作用最明顯，通常最小的用量就能起到明顯的效果[6]。

圖3 不定芽誘導(dǎo)分化

圖4 不定芽誘導(dǎo)分化

在加拿大楊叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，采用MS+0.15mg·L-1TDZ+1.25mg·L-16-BA+0.125mg·L-1NAA這個配比的培養(yǎng)基叢生芽誘導(dǎo)率最高，高達(dá)86.7%，且叢生芽生長較好。在6-BA、NAA以及TDZ的協(xié)調(diào)作用下，成功誘導(dǎo)出叢生芽。器官的形成是由生長素與細(xì)胞分裂素的相互之間的比率所決定的，不是由絕對物質(zhì)濃度決定的[5]。同時，在加拿大楊叢生芽芽誘導(dǎo)過程中，低濃度的TDZ也起到了促進(jìn)作用。賈小明等人[7]在新疆楊(P.alba L.var.pyramidais）和河北楊（P.hopeiensis Huet Chow）莖段再生過程中都發(fā)現(xiàn)了TDZ的濃度對叢生芽分化有重要影響。較低濃度的TDZ有利于叢生芽的分化，較高濃度的TDZ則抑制叢生芽的分化。

［1］王金華．加拿大楊栽培技術(shù)及應(yīng)用［J］．現(xiàn)代農(nóng)村科技，2013（17）：55．

［2］C XU E，黃海，夏新興．加拿大楊木P-RC APMP漿及其漂白硫酸鹽漿的協(xié)同效應(yīng)［J］．國際造紙，2006，25（6）：16-19．

［3］唐啟義，馮明光．實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［M］．北京：科學(xué)出版社，2002：49-265．

［4］劉希華，曾淑蘭，丁昌俊，等．雷公藤以芽繁芽組織培養(yǎng)研究［J］．西南林學(xué)院學(xué)報，2009，29（1）：35-38．

［5］劉希華，毛玲榕，邢建宏．雷公藤愈傷組織誘導(dǎo)與懸浮培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)［J］．三明學(xué)院學(xué)報，2010，27（6）：577-580．

［6］王關(guān)林，方宏筠．高活性細(xì)胞激動素TDZ在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］．植物學(xué)通報，1997，16（1）：77-80．

［7］賈小明，樊軍鋒，王娟娟．河北楊和新疆楊離體葉片誘導(dǎo)不定芽研究［J］．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，34（12）：109-115．

（責(zé)任編輯：朱聯(lián)九）

Callus Induction and Adventitious Bud Regeneration from the Stem of Populus Canadensis

HUA Yang-jing,LIN Bi-yu,ZHAN Zhi-yong,YOU Jia-ji,LIU Xi-hua
(College of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Taking the stem of Populus canadensis as amaterial,the effect for callus induction and bud differentiation w ith different phytohormone was studied.The result showed that the time effect for the explants dealing w ith 0.1%Hgcl2 about 4.5 m in was the best.Themost suitable formula for induction of callus was MS+0.15mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA,callus induction rate was 60%.Themost suitable formula for shoot-inducing medium was MS+0.15mg·L-1TDZ+0.125mg·L-1NAA+1.25mg·L-16-BA,Multiple shoot clumps induction ratewas86.7%.

Populus canadensis；callus；adventitiousbud；tissue culture

S792．112

A

1673-4343（2014）02-0079-05

2014-01-20

福建省大學(xué)生創(chuàng)新項目（201311311024）；福建省科技廳重點項目（2011N 0030）；福建省教育廳科技項目（JA11249）。

花景陽，男，福建安溪人，大學(xué)生。通訊作者：劉希華，男，福建閩清人，博士，副教授。研究方向：生物技術(shù)。