范騰蛟，趙麗嬌，張 然，鐘儒剛

(北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100124)

煙草特異亞硝胺(tobacoo specific nitrosamine, TSNA)是煙草產(chǎn)品中特有的一類致癌物，由尼古丁和相關(guān)生物堿經(jīng)亞硝化產(chǎn)生，可誘發(fā)肺癌、食管癌、口腔癌、鼻腔癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、宮頸癌等多種癌癥[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)的TSNA主要有7種，其結(jié)構(gòu)示于圖1。其中4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)對嚙齒類動物具有較強(qiáng)的致癌性，被國際癌癥研究所(IARC)列為A1組致癌物質(zhì)[3-4]。NNK在細(xì)胞色素P450 (CYP450)的作用下發(fā)生代謝活化，生成活潑親電試劑，導(dǎo)致DNA損傷從而誘發(fā)癌癥。

圖1 煙草特異亞硝胺的結(jié)構(gòu)以及煙草生物堿前體Fig.1 Structures of TSNAs and precursors of tabacco alkaloid

CYP450催化下的α-羥基化反應(yīng)是NNK致癌的重要代謝途徑之一。NNK是非對稱亞硝胺：有兩條α-羥基化反應(yīng)代謝途徑，即α-甲基羥基化反應(yīng)途徑(pathway A)和α-亞甲基羥基化反應(yīng)途徑(pathway B)，其代謝機(jī)理示于圖2。途徑A是發(fā)生在嚙齒類動物肺中的主要反應(yīng)形式，可直接代謝產(chǎn)生4-羥基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)，代謝中間體(1)可與DNA發(fā)生吡啶基氧代丁基化作用，生成釋放HPB的DNA加合物，或者與血紅蛋白結(jié)合生成釋放HPB的血紅蛋白加合物[5]。途徑B可直接代謝產(chǎn)生醛酮和甲基重氮?dú)溲趸?2)，后者可與DNA反應(yīng)生成甲基DNA加合物。研究表明，在人體中不同亞型CYP450催化NNK的α-羥基化反應(yīng)效率為2A13 > 2B6 > 2A6> 1A2 ～ 1A1 > 2D6 ～ 2E1 ～ 3A4[4]。CYP2A13在NNK的α-羥基化反應(yīng)中較其他亞型具有更重要的作用，且在呼吸道組織中的催化效率更高[6-7]，而CYP2A6在肝組織中的催化效率較其他組織高[8-9]，這使得NNK代謝具有一定的器官特異性。此外，NNK代謝還具有種族特異性，例如同樣是在肝中的α-亞甲基羥基化反應(yīng)，主導(dǎo)大鼠體內(nèi)NNK代謝的是1A2、2B1和3A三種亞型的P450，而主導(dǎo)人體內(nèi)代謝的則是2A6和3A4兩種亞型的P450[8,10]。

圖2 CPY450催化下的NNK代謝機(jī)理Fig.2 Metabolic mechanism of NNK catalyzed by cytochrome P450

目前已有大量關(guān)于NNK代謝產(chǎn)物測定的相關(guān)報(bào)道。Mullett等[11]利用自動固相微萃取-高效液相色譜(HPLC)技術(shù)檢測了NNK及其代謝產(chǎn)物HPB。Lee等[12]使用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)法檢測了A/J小鼠尿液中HPB等5種NNK代謝物。Chiang等[13]使用HPLC/MS法檢測了經(jīng)NNK處理的A549和H1437細(xì)胞中NNK、NNAL(4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇)和HPB的含量，結(jié)果表明在細(xì)胞中表達(dá)CYP2A13和CYP2A6可明顯增強(qiáng)NNK的代謝。Lang等[14]利用親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了兔血液中NNK及其代謝物HPB和NNAL等8種化合物，發(fā)現(xiàn)α-亞甲基羥基化反應(yīng)是NNK在兔體內(nèi)發(fā)生α-羥基化反應(yīng)的主要途徑。以上研究表明，HPB可以作為一種標(biāo)志物應(yīng)用于NNK體內(nèi)代謝活化并致癌的相關(guān)研究。

體外模擬代謝是研究外源化學(xué)物質(zhì)體內(nèi)代謝機(jī)制和代謝活性常用的實(shí)驗(yàn)方法。Wang等[15]和Sturla等[16]用4-(乙酸基甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNKOAc)模擬NNK代謝產(chǎn)物，測定了其導(dǎo)致的DNA加合物，結(jié)果表明，NNK-DNA加合物能夠釋放HPB，HPB可以作為NNK導(dǎo)致DNA損傷的生物標(biāo)志物。本研究采用高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-APCI-MS/MS)法對NNK體外模擬代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，旨在為TSNA致癌生物標(biāo)志物的相關(guān)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

TSQ Quantum高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；Z-323K型高速離心機(jī)：德國Hermle公司產(chǎn)品；BS-210S電子分析天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；PALL超純水裝置：美國Pall公司產(chǎn)品。

NNK、HPB、[3,3,4,4-D4]-HPB：加拿大Toronto Research Chemicals公司產(chǎn)品；大鼠肝微粒體：齊氏生物科技有限公司產(chǎn)品；葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽、還原型輔酶II四鈉鹽：百靈威(J&K Chemical)公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇(色譜純)、乙酸銨：美國Sigma公司產(chǎn)品；Microcon YM-30微孔離心過濾器：美國Millipore公司產(chǎn)品；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純)：天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；氯化鉀、氯化鎂(分析純)：北京化工廠產(chǎn)品；三羥甲基氨基甲烷(Tris，分析純)：北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB C18反相色譜柱(2.1 m×150 mm×5 μm)；柱溫25 ℃；流動相為10 mmol/L乙酸銨水溶液(A)和乙腈(B)，流速0.2 mL/min；檢測波長230 nm (二級管陣列檢測器)；梯度洗脫程序：0～5 min、98%A，5～15 min、98%～80%A，15～20 min、80%～75%A，20～25 min、75%～80%A，25～35 min、80%～98%A，35～45 min、98%A；進(jìn)樣量25 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 大氣壓化學(xué)電離源，正離子檢測模式；放電電流4.0 μA；霧化器溫度450 ℃；鞘氣(N2)壓力138 kPa；輔氣(N2)壓力35 kPa；離子傳輸毛細(xì)管溫度270 ℃；導(dǎo)管入口補(bǔ)償電壓60 V；碰撞壓力0.2 Pa；碰撞能量20 V；碰撞誘導(dǎo)解析能量5 V；質(zhì)譜定量分析采用選擇反應(yīng)掃描模式(SRM)，對m/z166→106和m/z170→106離子通道進(jìn)行監(jiān)測。

1.3 NNK體外代謝實(shí)驗(yàn)

向5支玻璃反應(yīng)管中分別加入300 μL 10%大鼠肝微粒體工作液(含30 μL大鼠肝微粒體原液)，180 μL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，6 μL濃度為1.65 mol/L的KCl溶液，6 μL濃度為0.4 mol/L的MgCl2溶液，30 μL濃度為0.05 mol/L的葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽溶液，48 μL濃度為0.025 mol/L的還原型輔酶II四鈉鹽溶液)，于37 ℃預(yù)熱20 min。將其中一只反應(yīng)管內(nèi)的溶液作為空白對照樣品，向另外4只反應(yīng)管中分別加入1 400 μL NNK溶液，用Tris-HCl溶液(10 mmol/L，pH 7.4)定容至10 mL，使NNK的濃度分別為0.01、0.1、1、10 mmol/L。各反應(yīng)管中D4-HPB內(nèi)標(biāo)物的濃度為100 nmol/L，于37 ℃反應(yīng)12 h，每小時(shí)分別從5支反應(yīng)管中取出200 μL反應(yīng)混合液，置于-20 ℃保存。待所有反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合液用YM-30離心過濾器過濾，待HPLC-APCI-MS/MS分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制濃度分別為0.2、0.8、2、8、20、80、200、400 nmol/L的HPB標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)物D4-HPB的濃度為100 nmol/L。以HPB和D4-HPB的濃度比為橫坐標(biāo)，HPB和D4-HPB的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

配制濃度分別為0.8、4、20、40 nmol/L的HPB標(biāo)準(zhǔn)溶液(D4-HPB內(nèi)標(biāo)濃度為100 nmol/L)，在擬定分析條件下，一天內(nèi)進(jìn)樣測定6次，得到日內(nèi)準(zhǔn)確度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；上述樣品分別在3日內(nèi)測定18次，得到日間精密度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。向空白對照樣品中分別加入HPB標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過與待測樣品相同的處理過程后，在擬定條件下進(jìn)行分析，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的靈敏度和準(zhǔn)確性

HPB和D4-HPB標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖及碎裂機(jī)理示于圖3，其主要碎片離子峰均為m/z106。采用SRM正離子模式監(jiān)測HPB的m/z166→106和D4-HPB的m/z170→106離子通道，所得離子流圖示于圖4，其中HPB和D4-HPB的保留時(shí)間分別為19.84 min和19.81 min。將HPB和D4-HPB的SRM峰面積比對其濃度比作圖，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖5。結(jié)果表明，HPB在濃度為0.2～400 nmol/L范圍內(nèi)，HPB和D4-HPB的濃度比與SRM峰面積比的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。方法準(zhǔn)確度和精密度的測定結(jié)果列于表1。由表1可知，方法的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度分別為97.2%～101.8%和96.6～101.1%；日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均為1.1%～3.2%。向空白對照樣品中加入不同濃度的HPB標(biāo)準(zhǔn)溶液，按與待測樣品相同的步驟進(jìn)行處理和分析，測得方法的加標(biāo)回收率為98%～103%，詳細(xì)數(shù)據(jù)列于表2。在擬定的分析條件下，以3倍信噪比(S/N)測得的HPB檢出限(LOD)為0.025 nmol/L，以10倍信噪比測得的HPB定量限(LOQ)為0.05 nmol/L。以上結(jié)果表明，本方法的靈敏度和準(zhǔn)確性均能滿足NNK代謝物的定量分析。

圖3 HPB (a)和D4-HPB (b)的二級質(zhì)譜全掃描圖Fig.3 MS2 full scan spectra for HPB (a) and D4-HPB (b)

圖4 HPB標(biāo)準(zhǔn)樣品(a)和D4-HPB內(nèi)標(biāo)(b)的SRM離子流圖Fig.4 SRM chromatograms for HPB standard(a) and D4-HPB internal standard(b)

圖5 HPB和D4-HPB的SRM峰面積比對其濃度比作圖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Calibration curve of HPB constructed by plotting SRM peak area ratio between HPB and D4-HPB versus their concentration ratio

樣品濃度/(nmol/L)日內(nèi)準(zhǔn)確度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=6)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%回收率/%日間準(zhǔn)確度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=18)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%回收率/%0.83.0101.83.198.041.197.21.196.6203.299.43.299.9403.0101.13.0101.1

表2 HPB在空白溶液中的加標(biāo)回收率

2.2 體外模擬NNK代謝產(chǎn)物HPB的測定

空白對照組和模擬代謝組中HPB的SRM離子流圖示于圖6。圖6a中m/z170→106離子通道在19.93 min出峰，而m/z166→106離子通道在此時(shí)沒有信號，表明空白對照組中沒有HPB；而圖6b顯示，模擬代謝組中有明顯的HPB譜峰，說明該方法的專屬性良好。在體外模擬代謝條件下，不同濃度NNK代謝物的測定結(jié)果示于圖7，可以看出，代謝產(chǎn)物HPB的濃度隨NNK濃度的增加和反應(yīng)時(shí)間的延長而逐漸上升。在反應(yīng)前2 h，NNK濃度為0.01 mmol/L和0.1 mmol/L的反應(yīng)體系中，代謝物HPB的生成量逐漸上升，但增長趨勢緩慢；NNK濃度為1 mmol/L和10 mmol/L的反應(yīng)體系中，HPB濃度隨反應(yīng)時(shí)間的延長而顯著上升，9 h后上升速率逐漸減緩。Richter等[17]對NNK在倉鼠、大鼠、小鼠及人類肺組織中的代謝反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人肺組織中的主要代謝產(chǎn)物是HPB；而且NNK在人肺中代謝的主要產(chǎn)物和動力學(xué)特征與嚙齒類動物有顯著差異，表明NNK的代謝機(jī)制與不同亞型P450的參與有關(guān)。與動物實(shí)驗(yàn)相比，本研究所建立的NNK體外模擬代謝體系為闡明不同物種、不同器官中各類亞型P450催化下NNK代謝及其反應(yīng)動力學(xué)之間的差異提供了一種更加簡單、直接，而且具有高靈敏度和專屬性的研究方法。

注：圖6b為HPB和D4-HPB在NNK濃度為1mmol/L下反應(yīng)6 h的離子流圖圖6 空白對照組(a)和體外代謝組(b)中HPB和D4-HPB的SRM離子流圖Fig.6 SRM chromatograms for HPB and D4-HPB of the blank group(a) and the in vitro simulation group(b)

圖7 不同濃度NNK代謝產(chǎn)物HPB的濃度變化Fig.7 Concentration of HPB metabolized from different concentrations of NNK

3 結(jié)論

本研究建立了NNK的體外模擬代謝模型，利用HPLC-APCI-MS/MS法對不同濃度NNK經(jīng)體外模擬代謝生成的產(chǎn)物HPB進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，大鼠肝微粒體中的P450能夠?qū)⒎磻?yīng)體系中的NNK代謝為HPB，且HPB濃度隨NNK濃度的增加和反應(yīng)時(shí)間的延長而上升。該體外模擬代謝體系可用于探討不同亞型P450催化下的煙草特異亞硝胺代謝活化的反應(yīng)動力學(xué)研究，以闡明其代謝作用的分子機(jī)制，并為煙草特異亞硝胺致癌生物標(biāo)志物的相關(guān)研究提供可靠的定量分析方法。

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